基于双功能多价纳米抗体的三重信号放大竞争性免疫分析方法用于高灵敏检测咖啡中赭曲霉毒素A

《Analytica Chimica Acta》：Triple-Signal-Amplified Competitive Immunoassay Based on Bifunctional Multivalent Nanobody for High-Sensitivity Detection of Ochratoxin A in Coffee

• •
  基于多价双功能纳米抗体、酪胺信号放大和聚合辣根过氧化物酶的三重放大 ELISA 方法被开发出来
• •
  所提出的策略有望成为一种显著提高传统 ELISA 灵敏度的有效方法
• •
  三重放大 ELISA (TA-ELISA) 在咖啡样品中对 OTA 的检测限 (LOD) 为 183.6 ng/kg。

引言

OTA 是一种有毒的次级代谢产物，主要由曲霉属和青霉属的霉菌菌株合成，经常污染各种农产品，包括谷物、咖啡豆和干果产品¹。OTA 具有多种危险的毒理学特性，包括致畸作用、致癌潜力和免疫功能抑制²。基于全面的毒理学研究数据，国际癌症研究机构 (IARC) 于 1993 年将 OTA 归类为 2B 类致癌物，标志着其对人体的潜在致癌风险³。为了减少由 OTA 污染引起的公共健康危害，全球食品监管机构为所有食用食品中的这种霉菌毒素制定了严格的最大残留限量⁴。

咖啡是世界上最受欢迎的饮料之一，以其悠久的种植和加工历史以及独特的芳香风味特征而闻名⁵。多项临床研究结果也证实，适量饮用咖啡可以降低帕金森病、2 型糖尿病和某些恶性肿瘤等慢性病的发病率6, 7, 8。然而，咖啡原料中的 OTA 残留污染给食品安全监管工作带来了突出的潜在风险。为了控制咖啡成品中的 OTA 残留水平，中国国家卫生健康委员会 (CNHC) 设定了不同的限量标准：速溶咖啡限制为 10.0 μg/kg，而烘焙咖啡豆和咖啡粉分别控制在 5.0 μg/kg 以下。同时，欧盟委员会在 2023 年更新了其污染物控制法规，将烘焙咖啡的允许 OTA 含量降至 3.0 μg/kg，速溶咖啡降至 5.0 μg/kg⁹。这些不断收紧的监管阈值凸显了开发更灵敏、更稳定的 OTA 检测方法的必要性，特别是在考虑到咖啡基质中复杂的成分（包括脂质、天然色素和植物蛋白），以及 OTA 实际残留浓度极低增加了微量检测的难度¹⁰。

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 由于其检测成本低、样品通量高且操作流程简单，已被广泛应用于食品污染物筛查。尽管一些商业 ELISA 试剂盒在霉菌毒素检测方面取得了良好的灵敏度，但其卓越性能高度依赖于具有超高分辨力和特异性的优质抗体。针对如 OTA 这样的小分子霉菌毒素获得如此优质的抗体试剂在技术上仍然具有挑战性且成本高昂。为了降低对抗体性能的严格要求并进一步提高对复杂食品基质中微量 OTA 残留的检测能力，多种竞争性免疫测定的优化策略引起了越来越多的关注，包括转变信号输出模式、调整包被抗原的亲和力、筛选高亲和力抗体试剂以及引入多级信号放大系统11, 12。在可用的放大策略中，TSA 信号放大和 SA-PolyHRP 聚合酶探针已被证明可以显著提高 OTA 检测的灵敏度。Wang 等人将经典的 TSA 放大与碱性磷酸酶催化的反应相结合，构建了基于金纳米双锥体的光热免疫测定法，实现了在玉米和葡萄汁中对 OTA 的灵敏检测，检测限低至 0.20 ng/mL¹³。Song 等人利用 SA-PolyHRP 聚合探针的高酶负载能力，大幅提升了催化信号输出，并有效降低了 OTA 免疫测定的检测限¹⁴。另一种主流的优化方法是利用多聚抗体片段以增强抗原结合能力，这可以有效地捕获极低浓度水平下的目标分析物15, 16。在所有抗体片段类型中，骆驼科来源的单域纳米抗体在基因重组和蛋白质修饰方面表现出突出的优势¹⁷。迄今为止，许多研究通过连接自组装肽构建了自组装多价纳米抗体聚合物，并将这些聚合物应用于免疫测定检测、疾病诊断和生物医学治疗领域17, 18, 19。在我们之前的工作中，我们通过基因工程技术构建了一种用于基于 ELISA 的 OTA 检测的七聚体纳米抗体 Nb28-C4，与单体纳米抗体检测模式相比，引入这种多聚体示踪剂使整体检测灵敏度提高了 175.56 倍²⁰。尽管 TSA 放大、SA-PolyHRP 聚合探针和多价纳米抗体可以独立提高检测灵敏度，但大多数现有研究仅采用单一或双重放大模式。很少有报道构建了用于复杂食品基质中微量 OTA 检测的多级协同放大 ELISA 平台。

基于我们之前对多价纳米抗体单体的研究，本工作融合了 OTA 特异性纳米抗体 Nb28、自组装肽 (C4) 和链霉亲和素结合肽 (SBP)，合成了新型双功能多聚体纳米抗体 (Nb28-C4-SBP)。利用其抗原识别和链霉亲和素结合的双重功能结构域，我们将 TSA 和 SA-PolyHRP 集成在一起，构建了用于咖啡样品中微量 OTA 定量检测的三重放大竞争性 ELISA (TA-ELISA)。简而言之，TSA 利用 HRP 催化的自由基反应，将大量的生物素基团共价锚定到附近的固相蛋白上，并产生许多链霉亲和素结合位点。图 1 展示的核心工作原理包含三个协同放大模块以提高 TA-ELISA 的检测灵敏度：(1) 具有超抗原结合亲和力的自组装七聚体双功能纳米抗体，用于捕获微量 OTA 分子；(2) TSA 反应系统，沉积大量生物素残基，为链霉亲和素探针提供大量结合位点；(3) 携带多个 HRP 酶的 SA-PolyHRP 聚合物探针，以增强显色信号强度。经过对所有关键反应参数的系统优化，所建立的 TA-ELISA 的 IC₅₀ 值达到 0.152 ng/mL。与单放大 ELISA（仅 Nb28-C4-SBP 七聚体）相比，三重放大系统使 IC₅₀ 值降低了 3.93 倍；与双放大 ELISA（Nb28-C4-SBP 结合 TSA）相比，IC₅₀ 值降低了 2.20 倍。相应地，TA-ELISA 的检测限比单放大和双放大检测系统分别降低了 5.5 倍和 4 倍。SA-ELISA、DA-ELISA 和 TA-ELISA 的空白对照 (B₀，无 OTA 孔) 的 OD₄₅₀ 值分别为 0.082、0.294 和 0.458。如预期所示，随着额外放大模块的引入，背景信号逐渐增加。尽管多级信号放大不可避免地提高了背景吸光度，但竞争性信号变化的幅度得到了更大幅度的增强，使 TA-ELISA 能够实现降低 IC₅₀ 和检测限的卓越灵敏度。总之，我们开发了一种超灵敏、省时且易于操作的竞争性免疫测定方法，用于咖啡基质中 OTA 的定量分析。此外，结合多价双功能纳米抗体、TSA 生物素沉积和聚合 HRP 探针的多级放大策略，在提升针对微量污染物的各种免疫测定平台检测性能方面具有广泛的应用潜力。

部分摘要

化学品和试剂

质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司（北京，中国）。同源重组试剂盒由东酶生物技术有限公司提供（南京，中国）。限制性内切酶 Xho I 购自大连宝生物工程有限公司。用于 Nb28-C4 七聚体的重组质粒 (pET25b-Nb28-C4) 由本实验室按照之前的报道构建²⁰。自组装肽 (C4) 和 SBP（详细序列列于表 S1）的基因片段为

Nb28-C4-SBP 的表达与表征

C4 和 SBP 的完整基因序列列于补充表 S1。重组 Nb28-SBP 和 Nb28-C4-SBP 融合蛋白通过自动诱导原核表达技术获得，其全长氨基酸序列显示于表 S2。诱导培养后，可溶性目标蛋白成功表达并运输到大肠杆菌 E. coli Rosetta 细胞的周质空间，这些蛋白可以通过溶菌酶消化完全释放到上清液中

结论

基于我们之前关于七聚体纳米抗体单放大 ELISA 的研究，本工作设计了一种新型双功能多价纳米抗体 (Nb28-C4-SBP)，并构建了整合 Nb28-C4-SBP、TSA 生物素沉积反应和 SA-PolyHRP 聚合物探针的三重放大竞争性 ELISA (TA-ELISA)，用于咖啡基质中微量 OTA 的定量检测。这种三层放大策略显著提高了显色信号强度和整体检测

CRediT 作者贡献声明

包坤禄：撰写 - 初稿，方法论，数据管理。刘星：软件。刘子龙：可视化。曹红梅：验证，软件。吴龙：方法论，调查研究。陈奇：撰写 - 审查与编辑，监督，资源

利益声明

作者声明不存在可能干扰本文报告的研究数据真实性和客观性的潜在竞争性经济利益。

利益冲突声明

作者声明他们没有可能会影响本文报告工作的冲突。

致谢

本工作得到海南省自然科学基金（编号：322MS016）和国家自然科学基金委员会（编号：32260623）的资金支持。

包坤禄|刘星|刘子龙|曹红梅|吴龙|陈奇