野外十字园蛛（Araneus diadematus）疑似睡眠状态下的响应延迟增加

《Animal Behaviour》：Increased response latency in Araneus diadematus (Araneidae) during putative sleep in the wild

　　

睡眠是一种由多种行为和生理特征构成的复杂状态（参见R??ler & Klein, 2024的综述）。睡眠的首批行为学特征确立于100多年前，包括通常具有特征性的睡眠姿势、行为静止以及睡眠状态的可逆性。随后，更多的生理学特征被纳入，包括稳态调控（睡眠剥夺后睡眠的上调）以及觉醒阈值的升高（与清醒阶段相比，睡眠阶段需要更长或更强的刺激才能引起反应）（Campbell & Tobler, 1984；Piéron, 1913）。不同的睡眠阶段（如快速眼动睡眠（REM sleep）或非快速眼动睡眠（non-REM sleep））可进一步通过大脑活动的变化来定义（如Deboer, 2015）。尽管大多数物种缺乏睡眠的实验证据，但学界普遍认为所有动物都可能具有睡眠行为。睡眠已在包括刺胞动物、头足类和节肢动物在内的多个谱系中被记录（Hendricks et al., 2000；Iglesias et al., 2019；Nath et al., 2017；Shaw et al., 2000）。在脊椎动物中，睡眠已在爬行动物、鸟类和哺乳动物中得到确立（Blumberg et al., 2020；Rattenborg & Ungurean, 2023；Shein-Idelson et al., 2016），但不同睡眠阶段（如快速眼动睡眠和非快速眼动睡眠）的证据程度不一（Rattenborg & Ungurean, 2023）。 虽然在动物中通过实验确立睡眠的最佳方法是证明多项（或全部）睡眠标准，但展示睡眠与清醒状态之间觉醒阈值的差异是黄金标准。姿势或静止等其他标准可能相当不可靠，因为在某些极端情况下，动物在睡眠时仍会移动（例如军舰鸟在睡眠时仅使用大脑的一半，可同时睡眠和飞行；Rattenborg et al., 2016）。对于无脊椎动物等生物，由于其体型小且神经组织与脊椎动物不同，睡眠尤其难以证明。除果蝇（Drosophila）等模式生物外，对其他无脊椎动物睡眠的研究相对较少。这些研究包括刺胞动物（Nath et al., 2017）、腹足类（Vorster et al., 2014）、线虫（Trojanowski & Raizen, 2016）、多种头足类（de Souza Medeiros et al., 2021；Iglesias et al., 2019）、蜜蜂（Kaiser & Steiner-Kaiser, 1983）、淡水螯虾（Osorio-Palacios et al., 2021）和蝎子（Tobler & Stalder, 1988）。虽然睡眠已在所有这些动物中得到确立，但迄今只有头足类被证明表现出具有明显睡眠阶段的类似哺乳动物的睡眠结构（Pophale et al., 2023）。 在水母、腹足类或本研究主张的蜘蛛等非模式生物中确立睡眠，对于识别睡眠的基本功能及其潜在遗传机制（见Keene & Duboue, 2018）以及睡眠可塑性的环境相关性（Lakhiani et al., 2023）至关重要。此外，大多数睡眠研究是在受控的实验室条件下进行的，而野外条件下的睡眠研究需求已被有力论证（Loftus et al., 2022；Rattenborg et al., 2017；Reinhardt, 2020）。野外睡眠研究对于捕捉自然睡眠持续时间和模式非常重要，而这些在简单且要求较低的实验室条件下往往被夸大（例如食物易得、与其他个体或物种的互动有限；见Rattenborg et al., 2017）。野外研究的缺点包括对周围环境条件缺乏控制，以及在数小时或数天内追踪个体的困难。 蜘蛛的睡眠最近已被提示：R??ler等人（2022）记录了跳蛛的夜间行为阶段，这些阶段类似于哺乳动物和其他脊椎动物的快速眼动睡眠。这些阶段包括肌阵挛性抽动、明显的肌肉张力缺失（表现为腿部卷曲，可能是由于液压下降所致）以及视网膜运动。这些行为在夜间蜘蛛静止并采取特征性休息姿势时，以稳定的时长和间隔周期性发生（R??ler et al., 2021）。研究人员此后在众多蜘蛛谱系中记录了类似行为（D. C. R??ler，个人观察），包括圆蛛科蜘蛛（如十字园蛛（Araneus diadematus））。 十字园蛛是一种伏击捕食者，被认为主要在白天活动（Peters, 1970；Ramousse & Davis, 1976），但也有描述称其白天和夜间均活动（Nakamura & Yamashita, 1997）。与跳蛛（如R??ler et al., 2021）和其他非传统研究系统（如鲨鱼；Kelly et al., 2021）不同，十字园蛛没有明显可区分的活动和静止阶段。虽然蜘蛛在进食、梳理或织网时明显处于活动、清醒状态，但在网中心的静止期可能对应不同状态，包括警戒（清醒）、静止（准备捕食猎物）或睡眠样状态。研究人员的初步观察表明，十字园蛛在日落后会进行睡眠样行为（腿部卷曲和抽动阶段），提示睡眠相关的静止在夜间可能更频繁，但这并不排除白天存在类似睡眠期。 这项野外研究的目的是测试十字园蛛在静止期与活动期相比是否存在觉醒增强，以支持其睡眠状态的存在。如果蜘蛛在静止阶段睡眠，研究人员预测活动蜘蛛的觉醒阈值将低于静止蜘蛛。基于初步观察，研究人员进一步预测夜间的觉醒阈值高于白天，同时承认十字园蛛可能并非严格的昼行性动物。据研究人员所知，这是首个在无脊椎动物中明确测试觉醒阈值的实验性野外研究。

研究背景与问题

睡眠是一种由多种行为和生理特征构成的复杂状态，其行为学标准包括特征性睡眠姿势、行为静止、状态可逆性，以及稳态调控和觉醒阈值升高等生理特征。尽管实验证据在大多数物种中仍缺乏，学界普遍认为所有动物都可能具有睡眠行为。睡眠已在刺胞动物、头足类、节肢动物等无脊椎动物谱系以及爬行动物、鸟类和哺乳动物等脊椎动物中得到记录，但不同睡眠阶段的证据程度不一。在无脊椎动物中，除果蝇等模式生物外，其他类群的睡眠研究相对较少，包括刺胞动物、腹足类、线虫、头足类、蜜蜂、淡水螯虾和蝎子等，其中仅头足类被证明表现出具有明显睡眠阶段的类似哺乳动物的睡眠结构。在非模式生物中确立睡眠对于识别睡眠的基本功能、潜在遗传机制以及睡眠可塑性的环境相关性至关重要。此外，大多数睡眠研究在受控实验室条件下进行，而野外条件对于捕捉自然睡眠持续时间和模式非常必要，因为实验室环境的简单性和低要求往往会夸大睡眠参数。野外研究的缺点包括对周围环境条件缺乏控制以及追踪个体的困难。

蜘蛛的睡眠近期已被提示：R??ler等人（2022）记录了跳蛛夜间类似哺乳动物快速眼动睡眠的行为阶段，包括肌阵挛性抽动、肌肉张力缺失和视网膜运动，这些行为在蜘蛛静止并采取特征性休息姿势时周期性发生。研究人员此后在包括圆蛛科在内的众多蜘蛛谱系中记录了类似行为。十字园蛛（Araneus diadematus）是一种伏击捕食者，被认为主要在白天活动，但也有描述称其昼夜均活动，且没有明显可区分的活动和静止阶段。蜘蛛在网中心的静止期可能对应警戒、静止或睡眠样状态等不同状态。研究人员的初步观察表明，十字园蛛在日落后会进行睡眠样行为，提示睡眠相关的静止在夜间可能更频繁。因此，这项研究旨在通过测试十字园蛛在静止期与活动期的觉醒阈值差异，以实验证据支持蜘蛛睡眠状态的存在，并检验夜间静止蜘蛛的觉醒阈值是否高于白天。

研究设计与方法

研究人员于2023年8月和9月在德国康斯坦茨博登湖施穆格勒湾附近的灌木植被中开展野外观察和实验，研究对象为十字园蛛的末龄前和成年雌性个体。研究人员使用400 Hz正弦波、振幅在10秒内递增的声音刺激（通过iPhone 12 mini上的Audio Function Generator应用经迷你蓝牙音箱播放，距蜘蛛身体4–5厘米），测量蜘蛛抬起前腿的响应延迟作为觉醒阈值指标。实验设计为在白天和夜间分别测试活动状态和静止状态的蜘蛛，两次测试间隔至少6小时，并记录蜘蛛测试时的活动状态。研究人员共收集了67只个体的95次观察数据，其中26只个体被重复测试。部分蜘蛛在10秒刺激内无响应，研究人员用草叶轻触其身体使其活动后再测试以确认其感知能力。对28只个体测量了头胸甲宽度作为体型指标。统计分析使用R 4.2.1，采用广义线性混合模型（GLMM），以响应延迟为响应变量，分别构建三个模型检验体型、测试顺序以及时间和活动状态对响应延迟的影响。

研究结果

体型和测试顺序的影响

研究人员通过包含28只个体、49个响应延迟数据点的GLMM分析发现，体型（头胸甲宽度）对响应延迟无显著影响（χ2?=0.1688，P=0.681）。通过包含20只个体、40个响应延迟数据点的模型检验发现，测试顺序（白天先测或夜间先测）对响应延迟也无显著影响（χ2?=3.07，P=0.08），体型在该模型中同样无显著效应（χ2?=2.17，P=0.14）。

活动状态和时间对响应延迟的影响

基于61只个体、87个响应延迟数据点的GLMM分析显示，蜘蛛活动状态（活动/静止）（χ2?=26.85，P<0.0001）、时间（白天/夜间）（χ2?=26.21，P<0.0001）以及活动状态与时间的交互作用（χ2?=10.24，P=0.0014）均显著预测响应延迟。事后检验（Bonferroni校正）表明，白天活动和夜间活动的蜘蛛响应延迟无显著差异（z ratio=0.181，P=1.00），白天活动和白天静止的蜘蛛也无显著差异（z ratio=-1.665，P=0.575）。然而，夜间静止蜘蛛的响应延迟显著长于夜间活动蜘蛛（z ratio=-6.023，P<0.0001），也显著长于白天静止蜘蛛（z ratio=-6.034，P<0.0001）。

无响应个体的分析

在95次测试中，8只蜘蛛在首次刺激呈现的10秒内无响应，全部发生在静止状态，占所有观察的8.42%，其中夜间静止试验占5.56%，白天静止试验占13.95%。研究人员用草叶轻触激活这些蜘蛛后重新测试，其中7只对第二次刺激有响应，1只仍无响应被排除。将无响应个体分配最大响应延迟10秒后重新分析，活动状态和时间的交互作用仍显著预测响应延迟（χ2?=32.008，P<0.0001），事后检验确认白天静止与夜间静止蜘蛛的差异显著（z ratio=-2.958，P=0.0186）。

讨论与结论

研究发现，夜间静止蜘蛛的响应延迟显著长于夜间活动蜘蛛和白天静止蜘蛛，而白天静止蜘蛛与活动蜘蛛的响应延迟无显著差异。这一结果支持夜间静止蜘蛛处于疑似睡眠状态。研究人员排除了夜间温度较低、夜间捕食压力较低、视觉输入减少等非睡眠状态解释，因为这些因素同样应影响夜间活动蜘蛛，但夜间活动蜘蛛的响应速度与白天活动蜘蛛相当。白天静止蜘蛛中少数个体表现出延迟响应，且无响应个体全部出现在静止状态且白天占多数，提示十字园蛛可能具有类似果蝇的双峰睡眠模式，白天睡眠较短且觉醒阈值较低。实验室观察显示十字园蛛的腿部卷曲和抽动等快速眼动睡眠样行为仅在黑暗或黄昏出现，且与跳蛛的类似行为几乎相同，尽管两个蜘蛛谱系已分离至少2亿年。研究人员对确立十字园蛛睡眠持谨慎态度，计划扩展至稳态调控等额外行为标记，并测试睡眠对织网精度和交配表现等清醒行为的影响。

研究结论：这项野外实验研究首次在无脊椎动物中明确测试了觉醒阈值，发现十字园蛛夜间静止个体的响应延迟显著增加，支持其处于疑似睡眠状态，而白天静止个体可能主要处于静止而非睡眠状态。研究结果表明蜘蛛是研究自然环境中睡眠的有前景的系统。