马属动物体外胃系统的优化及其研究应用2. 样品处理方式与培养方法对饲料降解的影响

《Animal Feed Science and Technology》：Refinement of an in vitro gastric system for equids to investigate 2. The effect of sample handling and incubation method on feed degradation

　　

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  无容器包裹的饲料在孵育过程中可能损失更多的颗粒物。
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  孵育方法影响了可溶性物质的分布，而非残余损失。
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  分阶段孵育限制了可溶性物质在相之间的转移。
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  容器包裹饲料可提高样品回收率并减少过滤时间。
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  体外方案可能需要针对特定饲料进行调整。

引言

使用体外方案来预测饲料和营养物质的消化率提供了一种非侵入性且更为便捷的替代方法，相比于体内研究而言（Abdouli和Attia，2007；De Marco等，2014；Silva等，2024）。一种常用于预测体内消化率的常用方法是体外产气量（IVGP）技术（Longland等，2021；Zicarelli等，2023；Franzan等，2025），这是一种最初为反刍动物开发的降解模型（Menke等，1979），并后来被改编用于马属动物（Lowman等，1996；Lowman等，1999）。然而，直接发酵原料饲料对于马来说可能被认为在生理学上不具备代表性，因为体内饲料会首先在胃和小肠中经历盲肠前消化，然后在盲肠和结肠中发酵（Abdouli和Attia，2007；Merritt和Julliand，2013；Kara，2022）。这一点对于体外方法尤为相关，因为省略盲肠前消化阶段可能会影响底物可用性以及后续的发酵特性（Murray等，2005；Longland等，2021；Kara和Alt?nsoy，2024）。

这促使人们将其他物种开发的体外盲肠前方案进行改编（Furuya等，1979；Calsamiglia和Stern，1995；Hervera等，2007），并将其应用于马属动物研究中，以模拟盲肠和结肠发酵之前胃和小肠中的酶消化过程（Murray等，2005；Abdouli和Attia，2007；Varasteh等，2024）。最近的研究表明，同时纳入酶消化和发酵阶段可能会影响消化率的估算结果，与仅对饲料进行发酵相比（Longland等，2021；Kara和Alt?nsoy，2024）。

这些盲肠前方案被认为属于静态体外模型，在每一个消化阶段中使用商业化学试剂和酶，在恒定pH值和饲料与溶液比例的条件下模拟相关生理环境（Brodkorb等，2019）。动态模型旨在进一步捕捉复杂的消化过程，如pH梯度、食糜流动以及酶和消化液的逐渐分泌，但其运行和维护成本更高（Dupont等，2019）。在静态方案中，所有孵育阶段通常限定在同一个容器中，该容器保留前序孵育阶段释放的所有分子以供后续阶段使用。这需要定期进行干预操作，包括pH调节以及添加缓冲液和酶以模拟每个阶段的条件。这在涉及多次孵育和不同饲料特性时可能非常耗时。饲料通常以散装方式孵育，并在孵育后使用过滤方法进行回收，包括滤纸、尼龙滤膜和烧结玻璃坩埚，这些方法既耗时又存在颗粒物残留损失的风险（Murray等，2005；Abdouli和Attia，2007；Strauch等，2017；Garber等，2018）。

因此，研究人员探索了旨在解决上述问题的替代方法。此前的一项研究（Farci等，2021）将盲肠前消化的各个阶段分离在不同的烧杯中，并将袋装饲料在各阶段之间转移，作为体外近似于体内技术的方法（涉及移动袋和原位袋，Hyslop，2006）。分离孵育确保饲料仅接触相关的消化液，因此任何调节操作（如pH值）应更加省时。将饲料装入袋中便于回收消化后的残渣，该方法被同一作者在先前的研究中用于研究粒径、胃蛋白酶浓度以及唾液孵育对胃内饲料降解的影响（Taylor等，XXXX）。结果显示干物质（DM）损失升高，这可能是由于孵育后溶液未进行过滤而导致袋内颗粒物损失。饲料的小粒径（细磨[2毫米]或粗磨/粗切至15毫米的饲草）可能加剧了这一现象。作者建议在孵育后过滤溶液，以便准确量化DM损失。此外，当纳入唾液预处理阶段时，胃液孵育后的pH值（7.24–7.72）偏高，可能不利于胃蛋白酶的最佳活性（pH 2–4），从而可能限制了胃内蛋白质的降解。因此，在将饲料加入胃液时可能需要对胃pH值进行调节。

理想情况下，体外方案应具备可重复性、高效性和准确性。文献中此前使用的方法——包括将袋装饲料在分离的孵育阶段之间转移（Farci等，2021；Taylor等，XXXX），或始终在同一烧杯中孵育散装饲料（Longland等，2021；Kara和Alt?nsoy，2024）——尚未进行比较。这一比较有望实现标准化，并通过整合各方法的优点来优化方案。因此，本研究旨在评估不同的样品处理和孵育方法对饲料降解的影响，具体包括将饲料以以下方式孵育：1）散装方式，口腔和胃部阶段在同一烧杯中进行（LOOSE）；2）装在多孔袋中，在同一烧杯中进行（BAG）；或3）装在多孔袋中，在分别盛放口腔和胃部阶段的不同烧杯之间转移，同时加入从唾液溶液中过滤回收的残渣（TRANSFER）。

章节摘要

饲料

苜蓿颗粒（ALF）、草地干草（HAY）、稳定化米糠（RB）和未糖衣甜菜粕（SBP：未浸泡，S-SBP：按1:3的重量/体积比用水浸泡过夜）作为新鲜底物进行孵育，孵育前未经干燥处理。颗粒饲料（ALF、SBP）整体孵育，但RB因先前观察到整体孵育时物理分解不足、导致人为低估干物质消化率的情况，故在搅拌机中进行了粗磨处理（Moulinex Model 505，Windsor，英国）。

干物质损失

干物质（DM）损失（见表1）因饲料种类（P < 0.001）和处理方式（P < 0.001）而异。ALF的DM损失最高（0.19 ± 0.02），其次为HAY（0.13 ± 0.01）、RB（0.07 ± 0.0）、SBP（0.04 ± 0.0）和S-SBP（?0.01 ± 0.01），所有饲料之间均存在显著差异（P < 0.001），而S-SBP整体表现出DM增加的趋势。处理方式也影响了DM损失，LOOSE组的损失最高（0.12 ± 0.02），其次为TRANSFER组（0.08 ± 0.02）。最低损失观测于……

讨论

本研究在体外胃系统中评估了样品处理和孵育方法对饲料降解的影响。四种饲料经历了三种方法变体，其中饲料要么散装或袋装在单个烧杯中孵育，要么袋装后在分离的消化阶段之间转移。干物质损失因饲料种类和处理方式而异，而粗蛋白（CP）和可溶性碳水化合物（WSC）的损失在不同方法间大致相似。相比之下，蛋白质和葡萄糖浓度……

结论

干物质损失因孵育方法和样品处理方式而异。当饲料散装孵育或在分离的孵育阶段之间袋装转移时，损失更大。这表明增加的样品处理和转移操作导致了颗粒物残渣的损失。饲料中CP和WSC的损失在孵育阶段分离或限定在单一烧杯中的情况下相似。消化阶段的分离主要影响了……

CRediT作者贡献声明

D.E.F. Taylor：撰写——初稿、方法论、调查研究、数据整理、概念构思、形式化分析。V. Farci：撰写——审阅与编辑、概念构思、资源、方法论。J.A.M.D. Murray：概念构思、监督指导、资金获取。S.P. Daniels：撰写——审阅与编辑、概念构思、监督指导。P.A. Harris：撰写——审阅与编辑、概念构思、监督指导、资金获取。P.M. Hastie：撰写——审阅与编辑、概念构思……

利益冲突声明

作者声明与其他人员或组织不存在可能不当影响或偏颇本文内容的财务或个人关系。Harris博士受雇于资助机构WALTHAM宠物科学研究所（Mars宠物护理）。

致谢

本研究由格拉斯哥大学兽医基金与WALTHAM宠物科学研究所（Mars宠物护理英国）联合资助的博士奖学金支持。Mars宠物护理英国员工Harris博士在作为合著者的身份下，参与了研究构思、研究监督指导、资金获取以及稿件的审阅与编辑。资助机构未参与数据收集、数据分析、结果解读、稿件撰写或……

D.E.F. Taylor|V. Farci|J.A.M.D. Murray|S.P. Daniels|P.A. Harris|P.M. Hastie