皖西白鹅晚产蛋期与就巢期卵巢circRNA–miRNA–mRNA整合图谱鉴定候选ceRNA调控关系

《Genes》：Integrated Ovarian circRNA, miRNA and mRNA Profiling Identifies Candidate ceRNA Relationships Associated with Late-Laying and Nesting Stages in Wanxi White Geese

背景：皖西白鹅显著的就巢行为与卵巢快速退化以及产蛋量和繁殖效率降低相关。然而，circRNA通过协调ceRNA相互作用影响这一生理转变的程度尚未被充分理解。方法：在此，研究人员通过RNA测序（RNA-seq）在晚产蛋期（late-laying，LLG）和就巢期（nesting，NG）皖西白鹅中生成卵巢microRNA（miRNA）和circRNA表达谱，并测定血清生殖激素。结果：与晚产蛋期相比，就巢期以显著卵巢萎缩为特征。雌二醇（oestradiol，E₂）、孕酮（progesterone，P₄）和促黄体生成素（luteinising hormone，LH）血清浓度较低，而催乳素（prolactin，PRL）浓度较高。转录组分析鉴定出156个circRNA和64个miRNA符合名义差异表达（differential expressed，DE）标准。富集分析将产生DE circRNA的基因与膜和连接结构、细胞黏附、小GTP酶调控、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）–受体相互作用、黏着连接、黏着斑和代谢过程相关联。相反，DE miRNA的推定靶点与AMPK、mTOR、TGF-β和Hippo通路以及卵母细胞减数分裂相关联。RNA数据集的整合和Pearson相关分析突出了若干与卵巢功能转变相关的推定ceRNA关系。在晚产蛋期，生物信息学预测和表达相关性支持预测的novel_circ_001280-miR-1-y-CPEB1和novel_circ_005385-miR-187-x-BMP6关系，涉及与卵母细胞发育和卵巢内分泌功能相关的基因。相比之下，在就巢期，生物信息学分析支持一个推定的novel_circ_002435/novel_circ_007511-miR-135-x/z-FOXO3关系，可能与细胞静息、应激反应和卵泡闭锁相关。这些网络组分的表达谱显示与循环生殖激素浓度存在阶段相关相关性。结论：总之，这些发现提示一个与皖西白鹅卵巢功能重塑相关的探索性ceRNA图景，并鉴定出值得进一步功能验证的RNA关系。

皖西白鹅具有优质羽绒和理想肉用特性，但其显著就巢行为伴随卵巢从晚产蛋期向就巢期发生功能转变，导致卵泡闭锁、排卵停止和产蛋下降，降低繁殖效率与养殖效益。就巢行为涉及下丘脑–垂体–卵巢（hypothalamic–pituitary–ovarian，HPO）轴、生殖激素波动和产后转录调控网络。已有研究较多关注miRNA和lncRNA在卵泡发育、颗粒细胞凋亡与增殖及类固醇生成中的作用，而circRNA在禽类尤其是水禽就巢期卵巢退化与重塑中的调控作用仍不清楚。circRNA由反向剪接形成闭合环状结构，无5’帽和3’ poly(A)尾，抗外切酶降解，稳定且常具组织特异性，并可作为miRNA海绵参与ceRNA网络，影响凋亡、生殖发育和颗粒细胞分化。研究人员前期已描述皖西白鹅卵巢组织学和mRNA转录组，但未涉及非编码RNA。因此，研究人员开展卵巢circRNA、miRNA和mRNA整合分析，以鉴定与晚产蛋期至就巢期卵巢功能转变相关的候选ceRNA关系，为理解就巢分子基础及分子育种提供依据。

研究人员使用120只365日龄健康雌性皖西白鹅，来自安徽科技学院定远县水禽育种群。晚产蛋期定义为产蛋高峰后产蛋开始下降但未停止；就巢期定义为就巢行为持续至少4天并伴护巢防御、采食和活动减少。每阶段随机选10只采血，另随机选3只屠宰取卵巢。血清测定PRL、E₂、P₄、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、LH和促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）。结果发现，就巢期卵巢明显萎缩，成熟等级卵泡消失，仅余少量小白卵泡和小黄卵泡；E₂、P₄和LH显著降低，PRL显著升高，AMH和FSH无显著差异。转录组鉴定156个DE circRNA和64个DE miRNA，并整合已发表mRNA谱构建探索性ceRNA网络。优先提出novel_circ_001280–miR-1-y–CPEB1、novel_circ_005385–miR-187-x–BMP6和novel_circ_002435/novel_circ_007511–miR-135-x/z–FOXO3关系；前两者与晚产蛋期卵母细胞发育和卵巢内分泌功能相关，后者与就巢期细胞静息、应激和卵泡闭锁相关。该研究提示卵巢功能重塑涉及多个转录后调控模块，并为就巢和产蛋性能研究提供候选RNA与通路。

关键技术方法不超过250字：实验队列为120只365日龄皖西白鹅，源自安徽科技学院定远县水禽育种群；每阶段10只采血，3只取卵巢。主要方法包括血清ELISA检测生殖激素；TRIzol提取卵巢总RNA；rRNA去除链特异性文库和Illumina HiSeq 4000用于circRNA/mRNA测序，小RNA文库和Illumina HiSeq X Ten用于miRNA测序；HISAT2比对鹅基因组AnsCyg_PRJNA183603_v1.0，find_circ鉴定circRNA，Bowtie和miRBase鉴定已知及novel miRNA；edgeR和DESeq2鉴定DE RNA；GO和KEGG富集；miRanda与TargetScan预测靶点，Spearman和Pearson相关构建ceRNA网络；RT-qPCR验证16个RNA。测序数据登录号包括SRR30688733至SRR30688738和SRR40170502至SRR40170513。

结果部分：3.1 卵巢形态和血清激素浓度在晚产蛋期向就巢期转变中的变化：研究人员通过形态观察和ELISA发现，晚产蛋期卵巢含大量发育良好的排卵前等级卵泡，就巢期卵巢显著退化萎缩且无成熟等级卵泡；LLG的E₂、P₄、LH显著高于NG，PRL显著低于NG，AMH和FSH无显著差异。3.2 卵巢circRNA和miRNA测序数据质量评估：6个转录组文库获得567,948,958条原始reads，过滤后561,974,986条clean reads，clean比例98.23%–99.15%，Q30为90.20%–92.84%，比对率50.64%–72.41%，GC含量54.12%–62.37%；小RNA在NG和LLG平均原始reads分别为12,869,589和13,552,587，clean tags分别为12,552,255和13,287,161。3.3 皖西白鹅晚产蛋期和就巢期卵巢circRNA的RNA-Seq分析：样本间Pearson相关系数0.68–0.92，鉴定7565个circRNA，其中annot_exon 5693个（75.3%）、exon-intron 894个（11.8%）、one_exon 304个（4.0%）、antisense 277个（3.7%）、intergenic 199个（2.6%）、intronic 198个（2.6%）；多数circRNA由少于10条BSJ支持reads构成，长度主要在200–1500 bp，300–500 bp最多。3.4 皖西白鹅卵巢DE circRNA鉴定：以|log₂FC|≥1和p<0.05为标准，鉴定156个DE circRNA，其中107个在LLG高表达，49个低表达；高表达包括novel_circ_000178、novel_circ_003577、novel_circ_005385等，低表达包括novel_circ_002435、novel_circ_007511和novel_circ_001139。3.5 DE circRNA宿主基因富集的GO条目和KEGG通路：GO富集涉及膜、细胞连接、小GTP酶介导信号转导、细胞黏附等；KEGG富集涉及ECM–受体相互作用、黏着连接、黏着斑、脂肪细胞因子信号和TCA循环，提示结构重塑和代谢调控。3.6 皖西白鹅就巢期和晚产蛋期DE miRNA的卵巢表达模式：鉴定496个已知miRNA和125个候选novel miRNA；鉴定64个DE miRNA，LLG相对NG有12个上调和52个下调，即就巢期miRNA总体较高；LLG下调包括miR-1-y、miR-187-x等，上调包括miR-31-x、miR-72-x、miR-135-x、miR-135-z和novel-m0009-3p。3.7 DE miRNA预测基因靶点的GO条目和KEGG通路富集：GO富集涉及细胞骨架组织、信号转导和蛋白磷酸化；KEGG富集涉及细胞衰老、卵母细胞减数分裂、AMPK、TGF-β、mTOR和Hippo通路。3.8 连接circRNA、miRNA和mRNA的候选ceRNA网络组装：研究人员构建两个探索性网络，LLG中高表达的8个circRNA对应低表达miRNA和高表达mRNA；LLG中低表达的3个circRNA对应高表达miRNA和低表达mRNA；靶基因GO涉及膜功能、激素刺激反应、离子转运和细胞连接，KEGG涉及氮代谢、GnRH分泌、肾素分泌和胰岛素分泌。3.9 与晚产蛋期和就巢期相关的候选ceRNA关系鉴定：Pearson相关显示候选circRNA–miRNA负相关、miRNA–mRNA负相关、circRNA–mRNA正相关；支持novel_circ_001280-miR-1-y-CPEB1和novel_circ_005385-miR-187-x-BMP6等晚产蛋期相关关系，以及novel_circ_002435/novel_circ_007511-miR-135-x/z-FOXO3就巢期相关关系。3.10 血清激素浓度与候选ceRNA组分表达的相关性：多数LLG高表达circRNA与E₂、AMH、P₄、FSH、LH正相关并与PRL负相关；miR-1-y等与E₂、AMH、P₄、FSH、LH负相关并与PRL正相关；CPEB1、BMP6、PIP5K1C、LPIN3与E₂等正相关并与PRL负相关，FOXO3等则相反。3.11 mRNA、circRNA和miRNA表达模式的RT-qPCR评估：RT-qPCR验证16个RNA，结果与RNA-seq趋势一致，线性回归显示R²=0.9919。

讨论部分总结：该研究将卵巢形态、激素变化与circRNA/miRNA/mRNA表达整合，提示就巢期卵巢退化涉及卵泡生长和排卵程序减弱，以及细胞静息、应激适应和组织重塑程序增强。circRNA因稳定性和组织阶段特异性被视为生殖调控分子；本研究中约75%的circRNA来自外显子，与人类、小鼠和鸡等报道一致。虽然整体circRNA分布和类型未明显改变，但特定circRNA发生阶段相关差异表达，提示选择性重塑。讨论进一步联系miR-223-y、miR-144-y、miR-215-y、miR-31-x和miR-135-x/z在颗粒细胞增殖、类固醇生成、卵泡成熟和闭锁中的可能作用，并强调单个miRNA可多靶点、同一靶基因也可被多RNA调控。三个优先轴中，novel_circ_001280–miR-1-y–CPEB1可能与母源mRNA翻译激活和卵母细胞减数成熟有关；novel_circ_005385–miR-187-x–BMP6可能与颗粒细胞BMP信号、分化、FSH反应和类固醇生成有关；novel_circ_002435/novel_circ_007511–miR-135-x/z–FOXO3可能与PI3K-Akt下游FOXO3介导的细胞静息、应激和卵泡闭锁有关。GABRA2、HRH3、CACNA1C和FSTL1等高表达于就巢卵巢，涉及神经内分泌、离子转运、钙信号和分泌因子调节。激素相关性总体与就巢期内分泌特征一致。局限性包括每组仅3个生物学重复、跨6样本相关可能反映阶段差异、FDR<0.05且|log₂FC|≥1时仅有1个circRNA、2个miRNA和195个mRNA，11个网络circRNA均未达FDR标准，网络为探索性，靶点关系需功能实验验证，RT-qPCR使用同一批RNA样本而非独立队列。

研究结论翻译：总之，研究人员表征了皖西白鹅在晚产蛋期和就巢期的卵巢circRNA、miRNA和mRNA谱，并整合所得数据集提出探索性ceRNA框架。通路分析将DE circRNA宿主基因与膜和连接结构、小GTP酶介导信号转导、细胞黏附、ECM–受体相互作用、黏着连接、黏着斑和代谢调控相关联。相反，DE miRNA预测靶点富集于AMPK、mTOR、TGF-β和Hippo通路以及卵母细胞减数分裂。整合分析优先提出三个推定关系。在novel_circ_001280–miR-1-y–CPEB1和novel_circ_005385–miR-187-x–BMP6关系中，circRNA和靶mRNA在晚产蛋期较高，而相应miRNA在就巢期较高；这些关系可能一方面与母源mRNA翻译激活和减数成熟相关，另一方面与颗粒细胞BMP信号相关。相比之下，在novel_circ_002435/novel_circ_007511–miR-135-x/z–FOXO3关系中，circRNA和FOXO3在就巢期较高，而miR-135-x和miR-135-z在晚产蛋期较高；该关系与细胞静息、应激反应和卵泡闭锁相关表达模式有关。这些组分表达与循环E₂、P₄、AMH、LH、FSH和PRL浓度相关。由于所提关系尚未经实验验证，应将其视为预测；这些观察为功能测试提供初步基础，并值得在未来水禽就巢和产蛋性能研究中进一步评估。