反硝化细菌主导华北蔬菜地土壤N2O排放，nirK型反硝化细菌作用关键

《Applied Soil Ecology》：Denitrifying bacteria dominate N 2O emissions from a North China vegetable soil with a crucial role of nirK-type denitrifiers

　　

•本研究强调了反硝化细菌的作用。•NirK型反硝化菌对N?O产生的贡献显著（55%）。•nirS占主导地位的反硝化菌的ε15NSP为?0.2 ± 1.9‰。•N?O还原为N?的εr15NSP为?3.6 ± 1.0‰。•在经DDTC测试的土壤中，化学反硝化对N?O产生的贡献可忽略不计。

引言

灌溉和氮肥投入过量的蔬菜土壤是微生物反硝化驱动的一氧化二氮（N?O）排放热点区（Qasim等，2021；Gu等，2023）。鉴于N?O是一种强效温室气体（GHG），且是导致平流层臭氧耗损的重要因素（Robertson和Vitousek，2009），针对N?O产生与消耗机制的定向研究对于制定有效的减排策略、减少这些农业生态系统中的氮素流失至关重要。

微生物反硝化是一个分步的酶促还原过程，将NO??依次还原为NO??、NO、N?O和N?，分别由NO??还原酶、NO??还原酶、NO还原酶和N?O还原酶催化。该过程涉及多种微生物，包括携带nirK/nirS基因的细菌以及反硝化真菌。在集约化管理的蔬菜土壤中，高氮素投入和频繁灌溉往往使反硝化成为支配N?O排放的主要途径（Maeda等，2015；Li等，2021；Zheng等，2022；Zhuang等，2024；Zheng等，2025）。细菌反硝化既是N?O的来源，又通过N?O还原酶将N?O还原为N?，是已知的主要生物汇；而真菌反硝化以N?O作为终产物，缺乏该还原能力。因此，在这种反硝化主导的条件下，真菌与细菌反硝化的相对贡献会影响N?O的净排放。

此外，nosZ基因与nirS的共现频率高于与nirK的共现频率（Graf等，2014），表明nirS型反硝化菌具有更强的完全反硝化潜力，因此在适宜条件下对N?O净排放的贡献可能较小。然而，这种基因组潜力是否转化为原位活性，从而实际影响N?O通量，仍有待功能性验证。这引出了核心研究问题：在集约化管理的蔬菜土壤中，是真菌还是细菌主导N?O排放？nirK型和nirS型反硝化菌在塑造N?O净通量中分别扮演什么角色？

为填补这些空白，Anderson和Domsch（1975）提出的底物诱导呼吸抑制法（SIRIN）已被广泛应用于区分真菌与细菌反硝化对N?O排放的贡献（Laughlin和Stevens，2002；Ma等，2017；Huang等，2017；Chen等，2014；Rohe等，2021）。该方法利用链霉素或放线菌酮等抗生素选择性阻断土壤中的细菌或真菌蛋白质合成，从而分别定量细菌和真菌的N?O产生（Laughlin和Stevens，2002）。然而，SIRIN存在局限：无法评估N?O向N?的还原，可能存在抑制不完全的问题，且无法区分nirK型与nirS型反硝化菌。

同位素方法利用O（δ18O）的同位素组成以及N?O分子内两个非对称结合氮原子（Nα和Nβ）之间的15N差异，即15N位点偏好（δ15NSP），以同时定量真菌与细菌反硝化以及N?O向N?的还原。该方法基于这样一个事实：由于同位素分馏效应，真菌与细菌反硝化所产生的N?O表现出不同的δ15NSP和δ18O值（Lewicka-Szczebak等，2016；Yu等，2020）。此外，N?O向N?的还原所伴随的同位素效应，该过程仅存在于细菌中，并可被10 kPa乙炔部分阻断（Kaden等，2020），可提高残留N?O的δ15NSP和δ18O值。这些同位素指纹已被整合进双同位素映射方法（δ15NSP/δ18O MAP），用于定量细菌和真菌反硝化对N?O产生和还原的贡献（Li等，2021；Zheng等，2022；Lewicka-Szczebak等，2017）。然而，MAP方法所依赖的端成员值完全来自纯培养物和土壤培养实验，且其范围较宽（细菌反硝化：δ15NSP ?7.5–3.7‰，δ18O 16.7–23.3‰；真菌反硝化：δ15NSP 30.2–39.3‰，δ18O 40.6–51.9‰）（Yu等，2020；Lewicka-Szczebak等，2017；Toyoda等，2017；Sutka等，2008；Rohe等，2017），导致在分配土壤N?O产生和消耗过程中细菌与真菌的贡献时存在相当大的不确定性。

因此，这两种方法在本质上具有互补性。SIRIN可直接定量真菌和细菌对N?O产生的相对贡献，但无法评估N?O向N?的还原。相比之下，同位素方法可同时分配真菌和细菌对N?O产生的贡献，并定量N?O还原的程度，从而弥补了SIRIN留下的空白。此外，由于两种方法基于不同的分析原理，其结果的一致性可以增强对分配结果的信心，减少对单一方法的依赖。重要的是，化学反硝化产生的非生物源N?O所具有的δ15NSP值明显不同于细菌反硝化，但与真菌反硝化的值相似。因此，当细菌反硝化占主导地位且观测到的δ15NSP未偏向化学反硝化的特征范围时，这表明化学反硝化的潜在贡献相对于占主导的细菌反硝化而言是次要的，不太可能对整体N?O同位素特征或净排放估算产生显著影响。遗憾的是，在这方面，Rohe等（2021）试图结合同位素与SIRIN来估算反硝化真菌贡献的尝试失败了，因为在所测试的土壤中检测到了大量无法抑制的N?O排放，且其δ15NSP值无法归因于任何已知途径。

我们的目标是通过对华北地区蔬菜土壤进行无氧培养，定量关键反硝化菌对N?O产生和消耗的贡献，并解释观测到的同位素值变化。具体而言，我们旨在回答以下问题：（i）细菌与真菌反硝化对N?O产生和还原的相对贡献如何？（ii）nirK型和nirS型反硝化菌在该过程中扮演什么角色？为回答这些问题，我们采用了N?O同位素种分析，包括δ15NSP/δ18O映射法（MAP）和同位素端成员混合模型（IEM），并结合使用杀菌剂和杀真菌剂的底物诱导呼吸抑制法（SIRIN）以及乙炔抑制技术（AIT）。此外，我们还使用了二乙基二硫代氨基甲酸盐（DDTC），这是一种已知的无细胞nirK酶活性抑制剂（Shapleigh和Payne，1985；Maeda等，2017），通过抑制nirK反硝化菌介导的NO??还原来区分nirK型与nirS型反硝化菌的贡献。

章节片段

实验所用土壤

土壤样本采集自中国农业科学院顺义农业生态系统试验站（中国北京；40°15′ N，116°55′ E）一处菜地的表层0–20 cm。在采样前的七年里，该田地一直处于连续种植白菜的状态，最近三年种植大白菜，年施氮量为300 kg N ha?1 yr?1（Lin等，2020；Fang等，2021）。灌溉季节通常为……

抑制剂添加后N?O排放与无机氮含量的变化

在8小时培养期间，对照组（control）未加乙炔处理的累积N?O排放量为103.2 μg N kg?1，加乙炔处理的为214.4 μg N kg?1（图2a；表S4）。抑制剂添加显著降低了加乙炔和未加乙炔两组的N?O排放（p < 0.05）。在未加乙炔的条件下，CY使N?O释放抑制了20%，加入硫酸链霉素（ST）抑制了68%，而……

SIRIN和同位素方法揭示的细菌主导作用

基于SIRIN得到的fbD估计值为0.83（抑制剂加和比IAR为1.07时，针对未加乙炔处理）和0.86（IAR = 0.87，针对加乙炔处理），与基于同位素得到的fbD估计值（0.80–0.98）一致（见图3b）。我们承认，SIRIN与同位素映射方法均假设简化的两端成员系统，因此并不完全独立。尽管如此，两者的相符仍为细菌占主导地位提供了收敛性支持。接近理想的……

结论

本研究表明，双同位素图（δ15NSP/δ18O）与SIRIN方法对华北蔬菜土壤中细菌和真菌对N?O产生贡献的估算具有收敛性，凸显了二者的互补价值。结果一致表明，反硝化细菌主导了N?O的产生，其中nirK型反硝化菌的贡献显著。本研究使我们得以确定由nirS主导的硝酸盐向N?O转化过程的同位素特征……

CRediT作者贡献声明

Qian Zheng：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，软件，资源，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理，概念构思。Yujia Li：撰写——审阅与编辑，可视化，验证，方法论，调查研究，形式化分析，数据整理，概念构思。Boya Zhao：撰写——审阅与编辑，软件，形式化分析，数据整理。Fuli Fang：撰写——审阅与编辑，方法论。Weiqiang Feng：撰写——审阅与编辑，形式……

利益冲突声明

作者声明，不存在可能被视为影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究受喀什学院学术基金项目（编号：022024671）、中国农业科学院都市农业项目（编号：2025KY02）以及新疆领军人才引进计划：科技领域重点创新平台（基地）人才引进项目（编号：XJRC-2025-KJ-YJ-CXPT-089）资助。

Qian Zheng | Yujia Li | Boya Zhao | Fuli Fang | Weiqiang Feng | Shuaishuai Sha | Pan Xie | Zhiyong Qi | Yuxuan Wang | Shubin Zhang | Wei Lin