农达?诱导斑马鱼肝细胞系（ZF-L）产生氧化应激：Nrf通路和解偶联蛋白的作用

《Aquatic Toxicology》：Roundup? induces oxidative stress in zebrafish liver cell line (ZF-L): role of the Nrf pathway and uncoupling proteins

　　

## 摘要

草甘膦是全世界使用最广泛的除草剂，通过淋溶过程影响非靶标水生生物。先前的研究表明，这种农药会诱导氧化应激，然而负责减缓活性氧（ROS）产生和相关细胞损伤的机制仍知之甚少。因此，本研究旨在探讨农达?对解偶联蛋白（UCP2和UCP3）基因表达的影响、其对ROS产生的影响，以及Nrf2-ARE通路在这些过程中的参与作用。为此，将肝细胞样细胞（ZF-L细胞系）暴露于三种浓度的农达（65 μg L?1、650 μg L?1和6500 μg L?1）及对照组，暴露时间为24小时和48小时。结果表明，仅在高浓度暴露24小时后ROS水平显著升高，48小时后未观察到持续效应。这一结果与nrf2和ucp3基因的数据一致，其表达仅在24小时后增加。此外，本研究在nrf2和ucp3基因的启动子区域鉴定了ARE序列。在高浓度暴露24小时后观察到显著的氧化性DNA损伤，与对照组相比，48小时后损伤仍然升高。这些发现表明，农达会升高ROS水平，但该效应在48小时后减弱，可能是nrf2和ucp3激活的结果。然而，即使ROS水平和基因表达与对照组不再存在差异，48小时后DNA损伤仍然持续存在。

## 引言

草甘膦（N-(膦酰甲基)甘氨酸）是世界上使用最广泛的除草剂（Benbrook, 2016），以商品名农达?（Monsanto, St. Louis, MO, 美国）进行商业化销售。草甘膦的作用机制涉及抑制5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），该酶是植物生长所需氨基酸生物合成所必需的（Sch?nbrunn et al., 2001）。从理论上讲，草甘膦对非靶标动物的毒性较低，因为它们缺乏参与其作用机制的生化途径（de Brito Rodrigues et al., 2017）。然而，近年来已发现其对鱼类产生多种有害效应（Zheng et al., 2021; Lopes et al., 2022; Menéndez-Helman et al., 2025; Terrazas-Salgado et al., 2025）。

已有研究记录了草甘膦在全球各地地表水体中的存在，检测浓度因水生环境类型和农业使用强度而异。在美国开展的最大规模监测调查涵盖2001年至2010年间38个州采集的3732个样品，Battaglin等人（2014）在所有环境样品中39.4%中检测到草甘膦，最高浓度为427 μg L?1（Battaglin et al., 2014）。在阿根廷农业区，地表水中检测到的草甘膦浓度范围为100至700 μg L?1（Peruzzo et al., 2008）。在巴西南部，一条农业溪流中报告的草甘膦平均浓度为970 μg L?1（Lima et al., 2023）。在中国南京太湖，草甘膦浓度高达52 mg L?1（Shuai et al., 2023）。在阿根廷 Entre Ríos 省，地表水中报告的草甘膦浓度约为240 μg L?1（Sasal et al., 2017）。这些数值中的许多超过了主要环境保护机构为草甘膦设定的上限。在巴西，国家环境委员会（CONAMA）将地表水中草甘膦的最大允许浓度设定为65 μg L?1（CONAMA, 2005）。美国环境保护署（EPA）将饮用水中草甘膦的最大污染物限量设定为700 μg L?1（EPA, 2018），而欧洲共同体（EC）对饮用水中任何单一农药规定的最大允许浓度为0.1 μg L?1（EC, 1998）。

先前的研究表明，含草甘膦的制剂通过改变抗氧化防御系统的多个组分和/或导致ROS过度产生来诱导氧化应激。因此，显然细胞会持续采用机制来预防或减缓过量ROS的积累（MAILLOUX and HARPER, 2011）。抗氧化应激保护酶的诱导主要在转录水平发生，涉及一系列基因的表达激活，包括核因子2（Nrf2）。Nrf2是信号通路的一部分，被认为是抵御氧化应激最重要的机制之一，因为它与位于编码多种抗氧化和解毒酶的基因启动子区域的抗氧化反应元件（ARE）结合（Nguyen et al., 2009）。

线粒体膜电位与活性氧（ROS）产生之间的强相关性已被充分记载，其中即使膜电位的微小增加也可以引发ROS的产生。在此背景下，氧化磷酸化过程中的线粒体解偶联被认为是抵御氧化应激的第一道防线（BRAND and ESTEVES, 2005）。参与线粒体解偶联的机制包括解偶联蛋白（UCP）。这些蛋白是位于线粒体内膜的阴离子转运蛋白超家族成员，通过耗散质子梯度来解偶联氧化磷酸化（Krauss et al., 2005）。

目前，哺乳动物中已鉴定出五种UCP亚型。最初发现的亚型是UCP1，其功能与棕色脂肪组织中的热产生相关（Dicker et al., 1995）。随后，在其他组织中发现了额外的解偶联蛋白亚型（UCP2–UCP5），并与多种生理过程相关联（SREEDHAR and ZHAO, 2017）。Stuart等人首次证明草鱼和斑马鱼中存在解偶联蛋白，这些动物不调节体温，表明在这些物种中，解偶联蛋白参与与热产生无关的生理功能（Stuart et al., 1999）。

通过解偶联蛋白诱导质子泄漏已成为调节线粒体膜电位和控制线粒体ROS释放的机制（Jastroch et al., 2010）。因此，本研究旨在探讨农达?对斑马鱼肝细胞（ZF-L）氧化应激及相关细胞机制的急性效应。选择该细胞模型是因为肝脏在外源性物质生物转化和解毒中发挥核心作用，使肝细胞尤其适合研究污染物诱导的毒性机制。具体而言，评估了ROS产生、代谢活性、细胞呼吸以及一般性和氧化性DNA损伤，包括8-oxoG的形成，同时检测了nrf2、ucp2和ucp3的表达。选择这些基因是基于它们在抗氧化信号和线粒体ROS调控中的作用，以便研究解偶联蛋白和Nrf2-ARE通路在农达?引起的氧化应激中的潜在参与。细胞暴露24小时和48小时于65 μg L?1（处于环境水体报告浓度范围内）、650 μg L?1（代表根据此前在地表水中检测到的浓度选定的较高且环境上合理的暴露水平）以及6500 μg L?1（亚致死浓度，用于探究毒性底层的细胞机制）。

## 方法片段

### 细胞系和培养条件

肝细胞样细胞（ZF-L细胞系）购自美国标准生物收藏（ATCC?编号CRL-2643?）。细胞在28°C下在细胞培养瓶（Kasvi?，S?o José do Pinhais, PR, 巴西）中培养，培养基为LR培养基（50% Leibovitz L-15培养基，pH 7.4；40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基，pH 7.4；ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, 美国），补充0.2 g L?1碳酸氢钠、0.3 g L?1 L-谷氨酰胺、3 g L?1 HEPES、10%胎牛血清。

### 细胞耗氧量和代谢活性

农达?暴露对ZF-L细胞系具有细胞毒性，在最高浓度（相当于6500 μg L?1草甘膦）暴露48小时后，代谢活性显著降低（61.69%），与相应对照组相比（表2）。另一方面，活细胞数量和细胞耗氧量在任一测试浓度或时间点均未显示显著差异。

### 细胞内ROS形成和氧化性DNA损伤

在最高农达浓度（6500 μg L?1）下暴露导致显著……

## 讨论

在本研究中，我们评估了三种浓度的含草甘膦除草剂（农达）对斑马鱼肝细胞氧化应激参数的影响及其与解偶联蛋白的关系。我们的数据表明，农达会导致ROS水平升高、ucp3 mRNA表达增加、DNA损伤以及代谢活性下降。此外，据我们所知，这是首项在启动子区域鉴定ARE存在的研究……

## 结论

本研究显示，农达?暴露诱导了ZF-L细胞的浓度和时间依赖性细胞反应，其特征为活性氧（ROS）产生增加、DNA损伤以及与氧化应激相关的基因表达变化。24小时后ROS的增加伴随着所有测试浓度下nrf2表达的增加和高浓度下ucp3表达的增加，而ucp2表达保持不变。

## 生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明

在准备本作品期间，作者使用了ChatGPT- OpenAI以协助语言编辑。在使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。

## 合作者贡献

Robson Rabelo Velasques：概念构思、方法论、形式分析、调查研究、初稿撰写。Tainá Guillante：初稿撰写、审查与编辑。Simone Rutz da Costa：形式分析。Juliana Zomer Sandrini：形式分析、方法论、资源、资金获取。Luiz Eduardo Maia Nery：概念构思、方法论、写作 - 审查与编辑、资源、监督、项目管理与资金获取。Carlos Eduardo da Rosa：概念构思。

## 生成式AI和AI辅助技术在写作过程中的声明

在准备本作品期间，作者使用了ChatGPT- OpenAI以协助语言编辑。在使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。

本研究的合作者按照以下贡献进行标注：Robson Rabelo Velasques：概念构思、方法论、形式分析、调查研究、初稿撰写。Tainá Guillante：初稿撰写、审查与编辑。Simone Rutz da Costa：形式分析。Juliana Zomer Sandrini：形式分析、方法论、资源、资金获取。Luiz Eduardo Maia Nery：概念构思、方法论、写作 - 审查与编辑、资源、监督、项目管理与资金获取。Carlos Eduardo da Rosa：概念构思。

## 未引用参考文献

CONAMA - 国家环境委员会，2005；环境保护署 - EPA，美国，2018；NCBI - 国家生物技术信息中心，ND；CE - 欧洲委员会，1998

## CRediT作者贡献声明

Robson R. Velasques：写作 - 初稿，方法论，调查研究，形式分析。Tainá Guillante：写作 - 审查与编辑，写作 - 初稿。Simone R. Costa：形式分析。Juliana Z. Sandrini：资源，方法论，资金获取，形式分析。Luiz E.M. Nery：写作 - 审查与编辑，监督，资源，项目管理，方法论，资金获取，概念构思。Carlos E. da Rosa：写作 - 审查与编辑，监督，资源。

## 作者信息

Robson R. Velasques | Tainá Guillante | Simone R. Costa | Juliana Z. Sandrini | Luiz E.M. Nery | Carlos E. da Rosa

生物科学学院，里奥格兰德联邦大学，巴西里奥格兰德州里奥格兰德，邮编：96203-900