杂原子多环芳烃二苯并噻吩（DBT）与1-硝基芘（1-NP）对Vitta zebra的组织病理学损伤与抗氧化防御效应

《Aquatic Toxicology》：Histopathological and biochemical effects of heteroatomic polycyclic aromatic hydrocarbons (Dibenzothiophene and 1-Nitropyrene) in the nerite snail Vitta zebra

　　

硫和氮衍生的多环芳烃（S- and N-PAHs）是一类毒理学知识较少但已在新出现的环境样品中检出的物质。因此，本研究旨在首先评估暴露于二苯并噻吩（dibenzothiophene, DBT）和1-硝基芘（1-nitropyrene, 1-NP）对nerite snail（蜒螺）Vitta zebra的抗氧化防御、氧化损伤和组织病理学标志物的影响。动物暴露于10、50和100 μg/L的DBT和1-NP，并解剖以评估内脏团和肌肉足中的还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）以及谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate-cysteine ligase, GCL）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）、谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase, GR）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）活性，以及脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO），并分析消化腺的组织完整性。生化分析显示组织中无显著差异。然而，暴露于两种HPA无论浓度如何，均在消化腺中显示组织改变，以消化细胞肥大和增生、小管萎缩以及提示坏死的退行性区域为主。总之，结果表明DBT和1-NP在V. zebra中具有组织水平毒性潜力，可能通过不同于氧化还原代谢的机制激活，这突出了这些污染物在水生环境中的潜在风险。

海岸和河口环境是河流系统污染物排放的最终归宿，并常因娱乐、工业或航运活动出现局地污染源。油类和燃料等有机物质可能危害生物健康。多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）因在空气、水和土壤等环境介质中广泛分布和迁移，以及在水生生物中明确的毒性机制而受关注。沿海最常见的是优先PAHs，含两个或更多稳定苯环。优先PAHs可被生物吸收并经氧化还原和酶促生物转化代谢，但向碳链添加功能团可激活分子，与亚细胞组分相互作用导致细胞损伤，涉及DNA加合物、致畸和致癌效应，以及氧化失衡、活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量导致脂质过氧化（LPO）和重要器官细胞功能障碍。谷胱甘肽（GSH）代谢循环酶，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、谷胱甘肽还原酶（GR）和谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL），是抗氧化防御一线；谷胱甘肽S-转移酶（GST）在II相代谢中解毒亲电和疏水化合物，对PAH代谢物排泄重要。近年发现含杂原子的PAH衍生物，即杂原子PAHs，可由母体PAHs物理、化学和生物转化产生，含氧、硫或氮。目前假设这些衍生物可能比母体更活泼，因杂原子直接相互作用而无需生物活化即可诱导更大急性毒性。环境中有机硫化合物二苯并噻吩（DBT）和含氮化合物1-硝基芘（1-NP）已有对鱼类和啮齿类配子发生、胚胎发育、内分泌干扰和氧化应激影响的报道，但对软体动物等无脊椎动物的效应存在明显空白。软体动物在沿海生态系统动态中作为滤食者或碎食者占基础营养级，并通过壳形成参与钙循环。热带沿海环境中，腹足类Vitta zebra是环境和毒理学研究有前景的模型，分布于南美洲大西洋沿岸泥滩、岩石露头和红树林，参与营养循环，被认识为生物指示种，可能受河流和河口城市扩张威胁，但可能具有补偿性抗氧化防御而存活于历史影响环境，提示高生理可塑性。因此，研究人员评估DBT和1-NP不同浓度暴露下V. zebra氧化应激相关酶和非酶生物标志物及潜在组织病理改变。

研究人员从巴西帕拉州贝伦大都市区Cotijuba岛岩石露头采集80只成年个体，约16 mm壳长，依据联邦许可SISBIO/ICMBIO No. 100670-1，在实验室15天驯化。设阴性对照、溶剂对照（0.01% 二甲基亚砜，dimethyl sulfoxide, DMSO）以及DBT和1-NP各10、50、100 μg/L，每组10只，96小时暴露，结束后冰上麻醉处死。取内脏团和肌肉足做生化，取消化腺做组织学。结果显示生化标志物无显著差异，但两种PAHs所有浓度均引起消化腺组织改变，以肥大和增生、小管萎缩和坏死退行区为主。结论认为DBT和1-NP在V. zebra中具有组织水平毒性潜力，可能通过不同于氧化还原代谢的机制，突出这些污染物在水生环境中的风险。意义在于提示组织病理学标志物比抗氧化防御和氧化损伤指标更敏感，支持V. zebra作为实验模型。

主要关键技术方法：样本队列来源为巴西帕拉州贝伦大都市区Cotijuba岛岩石露头，采集80只成年Vitta zebra，约16 mm壳长，经15天驯化后按每组10只随机分为8组，进行96 h急性暴露。关键技术包括：暴露后取内脏团和肌肉足测定GSH、GCL、GPx、GR、GST和LPO等生化标志物；计算整合生物标志物响应（Integrated Biomarker Response, IBR）指数；取消化腺进行石蜡切片、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色，并以组织损伤程度（degree of tissue alteration, DTA）半定量评分；采用ANOVA/Tukey或Kruskal-Wallis/Dunn检验分析。

研究结果：3.1 生化分析：对内脏团氧化应激生物标志物分析未见组间统计学显著差异；肌肉足所有生化生物标志物亦无显著变化。通过GPx、GST、GSH、GR、GCL和LPO测定，作者得出DBT和1-NP未在这些组织中诱导GSH代谢周期相关反应或增加脂质损伤。3.2 IBR指数：通过IBR综合所有标志物。内脏团中，溶剂对照IBR值高于阴性对照；DBT组和最低浓度1-NP组IBR相似且低于溶剂对照；50和100 μg/L 1-NP组IBR相似且低于溶剂对照和其他组。肌肉足中，溶剂对照IBR高于阴性对照；10 μg/L DBT组IBR高于溶剂对照；中间浓度DBT与溶剂对照无显著差异；100 μg/L DBT和10 μg/L 1-NP相似且低于溶剂对照；50和100 μg/L 1-NP相似且低于溶剂对照。结论：DBT和1-NP在两种组织中诱导了不同于对照的多变量生物标志物响应，IBR可揭示单独分析不明显的模式。3.3 组织学分析：对消化腺进行组织学分析，暴露于DBT和1-NP的螺组织损伤显著高于阴性和溶剂对照，DTA值>100，提示广泛器官损伤。对照显示典型腺泡结构：组织化上皮由嗜碱性细胞和消化细胞围绕管腔，薄层结缔组织分隔。DBT和1-NP暴露后最常见病变为消化细胞肥大和增生，也见小管萎缩伴上皮厚度减少和管腔扩大；最高浓度DBT和所有1-NP处理见腺泡内退行区域提示坏死。DTA值：阴性对照10±1.1，溶剂对照9.3±1.5，DBT 10 μg/L 217±64.4，50 μg/L 568±191.2，100 μg/L 355±28.7；1-NP 10 μg/L 490.7±168.6，50 μg/L 554.7±87，100 μg/L 510.7±74.9。结论：急性暴露即使低浓度也可导致不可逆消化腺损伤，可能损害消化功能。

讨论总结：海岸环境受人类活动污染，评估河口生物毒性影响重要。本研究整合氧化应激标志物和组织病理。DBT和1-NP在两种组织中未诱导GSH代谢周期通路反应，也未增加脂质损伤。GSH既是抗氧化物，也是GPx和GST辅因子；GR维持GSH循环，GCL催化限速合成，保持该三肽和相关酶对氧化还原平衡重要。虽然孤立通路无变化，IBR揭示更明显反应。溶剂对照两种组织IBR高于阴性对照，可能因DMSO虽有抗氧化特性，也可诱导氧化应激，LPO贡献增加支持抗氧化防御激活；DMSO亲水性强，可能更易从暴露介质转运至组织。内脏团中所有暴露组IBR低于溶剂对照，提示分析生物标志物诱导低；中、高浓度1-NP组IBR特别低，提示较高剂量可能与抗氧化系统耗竭相关。肌肉组织中反应模式不同，可能因其直接接触暴露介质；DBT处理呈浓度依赖IBR模式，最低浓度10 μg/L显示抗氧化途径激活，酶学生物标志物贡献更大。总体，DBT和1-NP在两种组织诱导与对照组不同的多变量生物标志物响应。IBR将多个生物标志物结果合并为单一值，便于综合评估和组间比较。消化腺对细胞内消化、酶产生、营养吸收必需，并在污染物代谢、累积和解毒中中心作用；该器官改变提示对污染暴露的非适应性反应。无论浓度，急性DBT和1-NP暴露导致该器官不可逆损伤，提示低至10 μg/L即可诱导组织病理改变并潜在损害消化功能。研究限制为未测分析化合物在组织中的累积，无法知道多少PAHs被代谢产生毒性、多少潜在生物累积；但最显著效应随名义浓度增加，提示化合物更多被代谢而非累积。所有PAH暴露处理常见消化细胞肥大和增生，是污染物暴露后常见改变。肥大以细胞体积增加为特征，与污染物暴露下溶酶体膜质子泵功能障碍导致细胞质空泡增大有关；增生在腹足类与酶分泌增加、解毒活性和凋亡细胞吞噬有关。这些改变高频率可能代表防御和排泄DBT和1-NP的补偿机制，细胞体积和数量增加以满足代谢和排泄需求。萎缩在上部DBT浓度和所有1-NP处理常见。坏死以细胞破裂和上皮完整性丧失为特征，提示消化腺不可逆损伤；这些改变损害消化小管功能，降低营养吸收和消化效率，可能导致污染自然环境中亚营养和死亡风险增加。与优先PAHs如benzo(k)fluoranthene、phenanthrene和benzo(a)pyrene研究不同，后者报道抗氧化途径激活和脂质损伤增加。优先PAHs常见作用机制依赖细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）酶介导的氧化还原反应，可生成环氧化物等中间体并诱导氧化损伤。相反，DBT和1-NP等杂原子化合物与生物分子的相互作用可能不依赖氧化途径，其与遗传物质直接相互作用或极性可触发不同细胞修复机制或凋亡，最终导致器官结构损伤。该假设可解释抗氧化组分低反应同时支持组织学损伤。

研究结论部分翻译：Vitta zebra中观察到的反应表明，与抗氧化防御参数和氧化损伤指标相比，其对DBT和1-NP的组织学生物标志物更易感。肥大和增生的高发生率以及小管腺泡紊乱可能反映系统性影响，与两种PAHs的测试浓度无关，可能是本研究分析未检测到失衡的结果。这强调需要进一步毒理学研究并评估不同生物组织水平上的效应。总体而言，V. zebra在实验测定中表现出高敏感性，产生一致的生物学反应，强化其作为模式生物的适合性。