斑马鱼幼鱼暴露于类毒素-a与新烟碱类杀虫剂混合物引发的发育与行为紊乱

《Aquatic Toxicology》：Developmental and behavioral disruption in Zebrafish larvae by mixtures of anatoxin-a and neonicotinoids

　　

由蓝藻引起的有害藻华（harmful algal blooms）因水体富营养化和气候变化而在全球范围内加剧，对水生生态系统和公众健康构成日益严重的风险。在藻华期间，蓝藻会释放强效神经毒素，如类毒素-a（anatoxin-a），这是一种烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）激动剂，可导致快速神经毒性。同样，新烟碱类杀虫剂（neonicotinoid insecticides），包括啶虫脒（acetamiprid）和噻虫啉（thiacloprid），也靶向nAChRs，并经常污染水环境。尽管它们具有共同的作用模式且在环境中共存，但其联合毒性仍鲜为人知。本研究采用鱼类胚胎毒性（Fish Embryo Toxicity, FET）试验，评估了(±)-类毒素-a、啶虫脒和噻虫啉单独及联合对斑马鱼（Danio rerio）幼鱼的影响。亚致死终点包括形态学、形态计量学、心脏功能、运动行为和骨骼肌完整性。120小时的半数效应浓度（EC50）值分别为：(±)-类毒素-a 1.07 mg/L、啶虫脒 51.04 mg/L和噻虫啉 36.55 mg/L，证实了蓝藻毒素具有显著更高的效力。单独暴露导致运动活性受损、不受控制的运动和颤抖、心包增大、心率降低、发育改变（包括体长、眼径和鳔充气减少），以及肌肉组织紊乱（表现为体节角度增加和双折射降低）。二元和三元混合物经常产生协同相互作用，特别是在行为、心脏和肌肉相关的终点方面，其中几种组合诱导的毒性超过了基于浓度加和（concentration addition）模型的预测。值得注意的是，含有环境相关浓度类毒素-a的混合物引发了显著的行为、心脏毒性和神经肌肉损伤。这些发现表明，天然和合成的nAChR激动剂的共暴露可以显著增强发育毒性，并强调了将现实混合物情景纳入环境风险评估的必要性。

研究背景与科学问题

有害蓝藻水华（cyanoHABs）在全球范围内因水体富营养化和气候变化而加剧，严重威胁饮用水源安全和水生生态健康。蓝藻在暴发期间会释放多种毒素，其中类毒素-a（anatoxin-a）是一种非核糖体合成的生物碱，作为烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的强效激动剂，可引发快速神经毒性甚至呼吸麻痹死亡，被称为“极速死亡因子”。与此同时，新烟碱类杀虫剂（neonicotinoids）如啶虫脒（acetamiprid）和噻虫啉（thiacloprid）同样靶向nAChRs，因其高效、低哺乳动物毒性和昆虫选择性而成为全球最畅销的杀虫剂之一，但也对蜜蜂等非靶标生物造成严重影响。尽管这两类化合物均作用于相同分子靶点且在水环境中可能共存，但关于它们联合毒性的研究极为匮乏。现有急性淡水毒理学研究中，仅约15%评估了亚致死效应，而对蓝藻毒素与农药混合效应的认知几乎空白。因此，本研究旨在填补这一空白，系统评价(±)-类毒素-a与两种新烟碱类杀虫剂单独及联合暴露对斑马鱼（Danio rerio）幼鱼的发育、心脏、神经肌肉和行为影响，并揭示其相互作用模式（加和、协同或拮抗）。

研究方法与技术路线

研究人员采用经济合作与发展组织（OECD）第236号指南——鱼类胚胎急性毒性（FET）试验进行暴露实验。斑马鱼（WM品系，混合野生型基因型）饲养于瑞士联邦水产科学与技术研究所（Eawag）。主要关键技术方法包括：（1）液相色谱-高分辨串联质谱法（HPLC-MS/MS） 用于定量(±)-类毒素-a浓度；（2）高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD） 用于测定啶虫脒和噻虫啉浓度；（3）自动视频追踪与行为分析，利用DanioVision观察室结合EthoVision XT13软件记录幼鱼在不同光暗周期下的自发游泳距离；（4）心脏功能与形态测量，通过Basler高速相机录制视频后经DanioScope软件自动计算心率（beats per minute）及心包面积、体长、眼径、卵黄囊面积、鳔面积等参数；（5）骨骼肌结构双折射分析，利用偏振光显微镜检测肌节有序性，通过FIJI软件量化平均信号强度和体节角度。

主要研究结果

3.1 单一化合物的急性毒性

研究人员通过四参数逻辑斯蒂（4PL）非线性回归模型拟合浓度-效应数据，得到120小时半数效应浓度（EC₅₀）：(±)-类毒素-a为1.07 mg/L，啶虫脒为51.04 mg/L，噻虫啉为36.55 mg/L，证实类毒素-a的毒性远高于两种新烟碱类杀虫剂。实测浓度校正后的EC₅₀值与名义浓度基本一致。

3.2 混合物效应与机制洞察

基于浓度加和（CA）模型和实证评估策略（观测响应与预期响应偏差>±10%判定为非加和作用），研究人员发现二元和三元混合物在多个终点上偏离简单加和性，尤其运动活性、心脏功能和肌肉双折射表现出显著的协同效应。从机制上看，类毒素-a和新烟碱类杀虫剂均作用于nAChRs，共暴露可能导致持续受体激活、脱敏动力学改变或受体占用率增加，从而放大下游信号干扰。

3.3 斑马鱼幼鱼形态学评估

单一暴露中，不受控制的运动和颤抖是最突出的效应，最高浓度下发生率可达100%。啶虫脒与噻虫啉的二元混合物对幼鱼影响最为严重，不仅出现上述症状，还观察到头尾畸形、眼发育异常、轴向结构改变、卵黄变形和水肿等。几乎所有混合物组合均表现出协同或加和效应，三元混合物在几乎所有比例下均为协同作用。

3.4 发育参数评估

(±)-类毒素-a在最低测试浓度（0.1 mg/L）即可导致眼径减小；噻虫啉在高浓度下降低体长、眼径和鳔面积；啶虫脒影响范围更广，包括体长、眼径、卵黄囊面积和鳔面积。(±)-类毒素-a与啶虫脒混合后，卵黄囊面积显著增大且呈协同作用，而体长和眼径以拮抗为主。啶虫脒与噻虫啉混合在最高比例下体长缩短且呈协同作用。整体来看，运动能力下降、体长和眼径减小及鳔充气失败共同严重损害了幼鱼的游泳性能和生存适应能力。

3.5 心脏毒性

(±)-类毒素-a几乎在所有处理组中均引起心包面积增大；噻虫啉在最高浓度下使心包面积增加25%-75%并降低心率；啶虫脒在几乎所有处理组中使心包面积显著增大（最高达157%）并在最高浓度下降低心率。啶虫脒与噻虫啉混合后，所有组合的心包面积均增大且多数呈协同作用。(±)-类毒素-a与啶虫脒混合后，多个非等毒和等毒组合的心包面积增大且均为协同作用，部分组合心率降低也呈协同。(±)-类毒素-a与噻虫啉混合后，在类毒素-a≥0.45 mg/L且噻虫啉≥51.04 mg/L的组合中心包面积增大且几乎全为协同。三元混合物在所有处理组中均导致心包面积增大。

3.6 行为监测

黑暗期，所有(±)-类毒素-a处理组均呈现浓度依赖性运动距离减少（降幅13%-28%），啶虫脒效果最强（最高降幅82%），噻虫啉次之（40%-75%）。光明期则出现不同模式：中低浓度啶虫脒和噻虫啉处理后幼虫表现光寻求行为（运动增加），而最高浓度下抑制作用占主导。混合物中，啶虫脒与噻虫啉组合在黑暗期所有组合均呈协同作用并显著降低运动距离；(±)-类毒素-a与噻虫啉组合在黑暗期所有组合均降低运动距离；(±)-类毒素-a与啶虫脒组合在部分非等毒比例下降低黑暗期运动距离但多数为拮抗；三元混合物在黑暗期所有组合均降低运动距离。值得注意的是，含有环境相关浓度类毒素-a（0.004-0.011 mg/L）的三元混合物即能显著降低运动能力。

3.7 骨骼肌结构双折射评估

(±)-类毒素-a单独未影响肌肉完整性；噻虫啉在最高浓度降低双折射信号强度并增加体节角度；啶虫脒在最高浓度降低强度并增加体节角度。(±)-类毒素-a与啶虫脒混合后，部分组合肌肉面积强度下降（降幅27%）且体节角度增大，几乎所有组合呈协同作用；啶虫脒与噻虫啉混合后多数为拮抗或无交互；(±)-类毒素-a与噻虫啉混合后部分组合体节角度增大且所有组合呈协同；三元混合物在多个比例下体节角度增大。例如，(±)-类毒素-a与啶虫脒的C4组合（1+0.5倍EC₅₀）仅需约1/16的啶虫脒即可达到与高剂量单独暴露相当的体节角度变化，凸显协同增强效应。

3.8 环境意义

全球数据显示，北美和欧洲水库中类毒素-a的第95百分位浓度分别可达0.9 mg/L和7.48 mg/L。世界卫生组织（WHO）推荐的饮用水中类毒素-a急性暴露参考值为0.03 mg/L，娱乐用水为0.06 mg/L。本研究中，虽然单一类毒素-a的EC₅₀（~1 mg/L）超出这些环境水平，但在二元尤其是三元混合物中，心脏毒性、肌肉损伤和行为改变在类毒素-a浓度低至0.004-0.011 mg/L时即可发生——这完全处于环境报告范围内且低于WHO指导阈值。相反，新烟碱类杀虫剂的EC₅₀远高于实际环境浓度（通常为ng/L级别），但真实水体中极少存在单一污染物，常检出数十甚至上百种农药残留。混合物风险评估往往超过单化合物评估结果，“化学鸡尾酒”场景增加了加和或协同相互作用的可能性，尤其是对共享nAChRs作用模式的化合物。

结论与展望

本研究通过整合发育、心脏、神经肌肉和行为终点，证明(±)-类毒素-a与噻虫啉和啶虫脒的联合暴露能够改变各自单独暴露时的毒理学反应。多种混合物处理组产生了与浓度加和模型一致的协同相互作用，支持了共暴露于两类nAChR激动剂可改变其毒理学效应的假说。鉴于测试浓度高于典型环境水体报告值，这些发现应被解读为实验性危害信息而非直接的环境风险估计。研究强调，即使每种杀虫剂浓度在现行监管框架下被视为“安全”，它们的联合存在也可能超过敏感发育终点的效应阈值，因此必须将天然与合成化合物的混合物毒性纳入环境风险评估体系。