磷脂酶D1（PLD1）消融通过减轻肥胖相关胰腺水肿和抑制IL-1β表达缓解高脂饮食加重的急性胰腺炎

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Ablation of phospholipase D1 mitigates obesity-mediated pancreatic edema in a mouse model of acute pancreatitis

　　

磷脂酶D1（PLD1）消融减轻急性胰腺炎（AP）小鼠模型中肥胖介导的胰腺水肿
•PLD1消融减轻肥胖加重的胰腺水肿
•PLD1缺失促进再生相关转录组通路
•PLD1消融抑制肥胖加重的胰腺白细胞介素-1β（IL-1β）表达
•靶向PLD1有望减轻肥胖加重的AP

急性胰腺炎（AP）是一种累及胰腺及胰周组织的多因素炎症性疾病，全球每年影响超过250万人，且发病率持续升高。其典型特征包括组织损伤、胰腺酶产生和分泌失调、坏死、水肿及炎症细胞浸润，并伴随肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症介质局部和全身性过度产生。雨蛙素（cerulein）诱导的AP模型可再现与人类AP相近的临床和病理特征。肥胖是AP局部和全身并发症及死亡的风险因素。肥胖时过量脂肪组织通过leptin、IL-6、TNF-α等促炎介质诱导促炎状态，同时脂肪组织分泌adiponectin等抗炎介质以调节代谢功能障碍。胰腺等内脏周围内脏脂肪释放炎症介质，加重局部炎症和组织损伤。高脂饮食（HFD）喂养小鼠在AP模型中较瘦小鼠更严重，血清IL-6和白细胞介素-10（IL-10）更高。磷脂酶D（PLD）是一种脂信号酶，水解磷脂酰胆碱（PC）生成胆碱和脂质第二信使磷脂酸（PA），参与氧化应激和炎症。PLD1在AP、腹膜炎和类风湿关节炎等炎症疾病中表达上调，外周血单核细胞转录谱显示PLD1是AP模型中上调最显著的基因。然而，肥胖背景下PLD1在AP中的作用尚不清楚。AP机制涉及Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子（STAT3）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）等通路，PA可激活这些通路。雨蛙素可激活NF-κB及ERK1/2、JNK和p38等MAPK家族成员，胰腺腺泡细胞中NF-κB活性增加与细胞因子表达升高和AP严重度相关，STAT3参与多种细胞因子和生长因子受体表达并导致胰腺水肿和炎症改变。因此，研究人员在HFD诱导肥胖背景下探讨PLD1在AP中的作用，采用野生型（WT）或Pld1^-/-小鼠并给予对照饮食（CD）或HFD，再以雨蛙素诱导AP。研究显示，PLD1消融降低HFD介导的体重增加以及脂肪和瘦体重分布，减轻HFD诱导的胰腺炎严重度，部分通过减少胰腺水肿组织和降低IL-1β表达实现，提示PLD1在AP发病机制中发挥重要作用，靶向PLD1可能是减轻HFD加重AP的有用策略。

关键技术方法：研究人员采用6周龄C57BL/6 WT和Pld1^-/-小鼠；WT购自The Jackson Laboratory，Pld1^-/-在UC Davis Animal Facility in Meyer Hall繁育。小鼠随机接受CD（10%热量来自脂肪）或HFD（60%热量来自脂肪）18周，随后腹腔注射雨蛙素（50 μg/kg，每小时1次，共7次）诱导AP，48 h后处死；部分动物不注射雨蛙素作为组织学对照。体成分用EchoMRI评估；血清淀粉酶和脂肪酶检测；胰腺苏木精-伊红（H&E）染色并评分水肿、腺泡细胞坏死和炎症细胞浸润；雄性胰腺RNA-Seq由Novogene建库，Illumina NovaSeq X Plus 150 bp双端测序，比对GRCm39，使用DESeq2和基因集富集分析（GSEA）；RT-qPCR检测Il-6、Il-10、Il-1β和Tnf-α，以Gapdh归一，采用2^?ΔΔCt法；免疫印迹检测p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-ERK、ERK、p-STAT3、STAT3、Bcl-xL和Procaspase-9等。统计采用方差分析和Tukey多重比较等。

研究结果：
高脂饮食增加WT和Pld1^-/-小鼠体重和脂肪量。18周饮食干预后，WT-HFD小鼠体重显著高于WT-CD，Pld1^-/- HFD小鼠体重显著高于Pld1^-/- CD；Pld1^-/- HFD小鼠体重低于WT-HFD，但该差异仅在雄性中持续存在。体成分分析显示，WT-HFD和Pld1^-/- HFD小鼠脂肪量显著增加、瘦体重相应降低；皮下脂肪组织和内脏脂肪组织重量升高，棕色脂肪组织重量和肝脏重量无显著组间差异。CD小鼠每日热量摄入和克摄入高于HFD小鼠，Pld1^-/- CD小鼠食物摄入低于WT-CD，但WT-HFD与Pld1^-/- HFD无差异。血清leptin在WT-HFD和Pld1^-/- HFD中升高；adiponectin在WT-HFD中降低，雌性WT-HFD血清adiponectin高于雄性WT-HFD，Pld1^-/-饮食组间无显著差异。
PLD1和HFD对AP严重度标志的影响。雨蛙素诱导AP后，雄性WT-HFD小鼠胰腺重量高于WT-CD，雄性Pld1^-/- HFD高于Pld1^-/- CD，而Pld1^-/- HFD低于WT-HFD。未接受雨蛙素的小鼠无水肿证据。组织学检查显示WT-HFD胰腺水肿重于WT-CD，Pld1^-/- HFD水肿减轻。腺泡细胞坏死无显著组间差异，但部分HFD样本坏死水平较高。雨蛙素处理后48 h血清淀粉酶和脂肪酶无显著差异。研究终点炎症细胞浸润亦无显著组间差异。
AP胰腺中PLD1和HFD的转录组效应。RNA-Seq层次聚类显示，各实验条件按饮食聚集，提示HFD诱导的全局转录组调节较PLD1消融更明显。相对于各自CD诱导AP对照，HFD在WT中调节169个基因，在Pld1^-/-中调节353个基因；Pld1^-/- HFD与WT-HFD比较仅有14个差异基因。PLD1消融在HFD动物中上调Nlrp6、Ifi202b、Ctrc、Dynlt1b、Spmip11、Mup21和Rep15，下调Myom2、Mybpc1、Dsc3、Wnt4、Smim32、Tmem254和Pld1。GSEA显示，Pld1^-/- HFD相较HFD-WT显著富集Myc Targets V1、E2F targets、G2M checkpoint和未折叠蛋白反应，耗竭Myogenesis、Kras signaling_DN、apical junction和pancreatic beta cells等通路。HFD在两种基因型中促进炎症相关基因集（TNFα signaling via NF-κB、IL6/JAK/STAT3和inflammatory response）及脂质代谢基因集（adipogenesis和fatty acid metabolism），但PLD1消融在HFD背景下对这些通路的全局影响未达统计学显著。
PLD1和HFD对胰腺细胞因子基因表达的影响。RT-qPCR显示，非雨蛙素对照中所有饮食-基因型组各细胞因子无显著差异。雨蛙素刺激后，所有组Il1-β和Il-10表达显著增加，雄性TNF-α增加；雌性中除WT-CD外Il-6增加，雌性TNF-α刺激限于Pld1^-/-小鼠。在雨蛙素处理动物中，雄性WT-HFD胰腺Il-1β表达较WT-CD增加47.8倍；雄性Pld1^-/- HFD与Pld1^-/- CD无显著差异，PLD1消融阻止了雄性WT-HFD中HFD介导的Il-1β mRNA升高，雌性无显著差异。雄性Pld1^-/- HFD小鼠Il-6表达较Pld1^-/- CD增加17.6倍，WT-HFD与WT-CD呈类似趋势但未达显著；雄性Pld1^-/- HFD小鼠Il-10基因表达较WT-HFD显著降低34%，TNF-α表达无显著组间差异。
PLD1和HFD对炎症信号通路表达水平的影响。免疫印迹显示，STAT3、ERK或NF-κB磷酸化在各组胰腺中无显著差异。细胞生存方面，雄性Pld1^-/- HFD组Bcl-xL表达显著高于Pld1^-/- CD或WT-CD；雄性WT-HFD小鼠Procaspase-9水平较Pld1^-/- HFD显著降低。

讨论部分总结：PLD1在AP等炎症疾病中上调，促炎细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β可激活PLD1，沉默PLD1可抑制细胞因子和趋化因子产生；IL-1β通过NF-κB通路诱导PLD1表达。肥胖通过分泌脂肪因子和促炎细胞因子加重AP。本研究提示，PLD1消融减轻HFD诱导的AP加重，表现为胰腺水肿和胰腺重量降低，但胰腺重量降低限于雄性。HFD增加WT小鼠胰腺水肿，与既往报道一致，而Pld1^-/-小鼠该效应显著减轻。尽管水肿严重度不同，腺泡细胞坏死和炎症细胞浸润无组间差异，提示PLD1优先调节AP早期炎症特征。血清淀粉酶和脂肪酶在末次雨蛙素注射后48 h未升高，可能提示此时胰腺已恢复，早期峰值可能因终点选择而未被捕获。HFD增加血清leptin，WT-HFD和雄性Pld1^-/- HFD中adiponectin降低，PLD1消融未能完全正常化全身脂肪因子信号。转录组分析显示，PLD1消融在HFD小鼠中富集与细胞增殖相关的胰腺基因程序，这是AP后胰腺再生的关键组成部分；同时下调apical junction、myogenesis和Kras signaling DN特征，其前沿基因主要由细胞外基质和细胞骨架蛋白组成，通常在AP后组织应激和修复中短暂诱导。这些转录组特征与雨蛙素处理后48 h血清淀粉酶和脂肪酶正常化一致，提示此时正转向胰腺损伤恢复。PLD1消融还选择性增加抗炎基因Nlrp6和Ifi202b，并抑制HFD诱导的雄性胰腺Il-1β表达，提示存在促进AP严重度的PLD1–IL-1β前馈轴。NF-κB和STAT3磷酸化在48 h无显著差异，可能反映这些信号通路快速而短暂的动力学，其激活可能发生于更早期并在恢复期回落。Bcl-xL在雄性Pld1^-/- HFD中升高，Procaspase-9在Pld1^-/- HFD中高于WT-HFD，提示caspase-9活性较低和细胞生存增强，可能促进恢复；转录组还显示PLD1消融富集活性氧通路并增强抗氧化特征。研究局限包括48 h终点可能掩盖早期损伤标志的短暂差异，转录组分析为探索性、样本量小且仅纳入雄性，需更大规模并包含两性的队列验证。总体而言，研究人员鉴定PLD1为HFD相关胰腺损伤、炎症细胞因子表达和恢复动态的介导因子，提示靶向PLD1可能是减轻肥胖驱动AP加重的可行策略。

研究结论翻译：总之，研究表明，PLD1消融可降低HFD诱导的体重增加、脂肪和瘦体重分布、AP严重程度和促炎细胞因子表达。这些发现提示PLD1在AP和肥胖相关炎症的发病机制中发挥作用；然而，PLD1调节AP中炎症信号和代谢功能障碍的确切机制仍有待阐明。研究结果表明，靶向PLD1可能是减轻HFD介导的AP加重的一种有用策略。