数十年来，使用动物进行的 in vivo 暴露实验一直是推动生物学和环境科学发展的重要工具。然而，随着"3R"原则（替代、减少、优化）的日益推广以及旨在改善动物福利的实施方案的推进，越来越多的国家和地区出台了法规或指南，以促进非动物测试方法的应用并减少对动物实验的依赖。美国环境保护署（USEPA）设定了到2025年将哺乳动物研究请求和资助减少30%，并在2035年彻底取消所有哺乳动物研究资助的目标，同时鼓励采用替代测试策略（Wang et al., 2023; Habanjar et al., 2021）。其他脊椎动物，尤其是鱼类，同样受到相关法规的保护，一些欧盟成员国已提出建议全面禁止动物研究（Sneddon et al., 2017）。与此同时，细胞培养技术取得了长足进步，各种 in vitro 细胞模型正被用于替代 in vivo 暴露研究，从而大幅减少实验动物的使用量（Duval et al., 2017）。
然而，传统的二维（2D）细胞模型在 in vitro 培养和增殖方面也存在局限性（Wang et al., 2023; Yao et al., 2024）。在培养板中孵育72小时后，2D培养细胞的表型稳定性往往下降（Baarsma et al., 2022）。更具体地说，2D单层细胞无法完全重现 in vivo 组织微环境的关键特征，包括原生的三维（3D）结构、异质性细胞-细胞相互作用、细胞-细胞外基质信号传导以及空间营养和氧梯度（Carterson et al., 2005）。在环境毒理学中，评估新兴污染物在环境相关低浓度下且经过长期暴露时间的影响，对于表征其长期的生态和健康影响至关重要（Gerboles et al., 2023）。因此，传统的2D单层细胞不太适用于这些需要持续表型稳定性和类组织结构环境的慢性暴露和长期培养场景，而非一般性地不适用于环境毒性评估（Liu et al., 2013）。
自发现细胞可在基于胶原的基质中形成3D球体以来（Elsdale and Bard, 1972），3D细胞培养技术在过去二十年间迅速发展（Wang et al., 2023; Stampar et al., 2022; N and Ravi, 2023）。3D细胞模型已成为发育生物学和疾病病理研究中有价值的 in vitro 系统，与传统2D培养相比具有显著优势（Wang et al., 2023; Stampar et al., 2022; N and Ravi, 2023; Wang et al., 2025a; Han et al., 2025）。这种方法使 in vitro 培养细胞能够自组装成3D球体，从而克服2D系统在模拟 in vivo 细胞环境方面的固有局限性（Wang et al., 2023; N and Ravi, 2023）。为配合减少动物实验的努力，USEPA和美国食品药品监督管理局（FDA）已合作推动从动物模型向基于3D细胞培养的 in vitro 系统转变。
近年来，结合细胞生物学、物理学、微制造技术和组织工程的进展，实现了一系列源自人类细胞的3D细胞培养平台，包括类器官、3D生物打印构建物和器官芯片系统（Wang et al., 2023）。人类多能干细胞可被诱导分化为类器官，重现大脑、肠道、肝脏和皮肤等器官的关键结构和功能特征，这些模型已被应用于环境风险评估（Wang et al., 2023; Gerboles et al., 2023）。与人类3D细胞模型相比，鱼类3D细胞模型的开发和应用研究相对有限，这主要归因于稳定的鱼类来源 in vitro 细胞系的匮乏。例如，斑马鱼作为生态毒理学评估中广泛使用的模式生物（Bowley et al., 2024），目前常用的 in vitro 细胞类型仅限于肝细胞和胚胎细胞。尽管如此，基于鱼肝细胞的3D细胞培养系统，包括球体和基于水凝胶的微组织格式，近年来已得到开发。例如，鱼类肝脏3D球体比2D培养更准确地重现了肝脏组织的结构和功能特征，使其成为研究代谢和内分泌干扰的有价值工具。虹鳟肝细胞来源球体的代谢特性已得到研究（Uchea et al., 2015），并证实3D培养的肝细胞在长期培养中保持高活力和稳定性。斑马鱼肝（ZFL）球体的脂质组学和基因表达谱已被表征，并评估了与传统单层培养相比的代谢和功能差异（Wang et al., 2025b）。然而，鱼类肝脏3D模型在评估新兴污染物肝毒性方面的应用仍探讨不足。
对苯二胺（PPD）及其醌类衍生物（PPD-Qs）是新兴的环境污染物。PPDs是轮胎橡胶制造中大量使用的高产量抗氧化剂之一（Hua and Wang, 2023）。PPDs和PPD-Qs可从轮胎磨损颗粒中浸出并释放到环境中（Di et al., 2022; Hua and Wang, 2023; Tian et al., 2021; Wei et al., 2024）。例如，在香港的道路径流样品中，五种PPDs的浓度范围为40–3000 ng/L，中位数为240 ng/L。同样，PPD-Qs的浓度范围为740–3870 ng/L，中位数为2170 ng/L（Zhang et al., 2023）。现有证据表明，这些化合物对鲑科鱼类具有高度急性毒性，对鱼类种群稳定性构成重大威胁（Tian et al., 2021; Zhao et al., 2024）。在PPD-Qs中，N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺醌（6PPD-Q）因其对银鲑已得到充分记载的急性致死毒性而受到特别的监管关注（Tian et al., 2021）。除鲑科鱼类中的这些急性效应外，PPDs和PPD-Qs还被证明可诱导其他鱼类物种的内分泌干扰和神经毒性（Varshney et al., 2022; Peng et al., 2022）。据报道，经口给予小鼠6PPD和6PPD-Q可导致剂量依赖性的肝脏蓄积，提示潜在的肝损伤（Fang et al., 2023）。然而，PPD-Qs在鱼类中的肝毒性在很大程度上尚未被表征，尤其是在环境相关浓度下经过长期暴露的情况。在本研究中，首次采用低黏附板方法建立了斑马鱼肝细胞球体。随后利用这些球体评估了6PPD-Q和 N-异丙基-N'-苯基-1,4-苯二胺醌（IPPD-Q）的肝毒性。对球体生长和表型特征、基因转录及caspase-3水平进行了评估。本研究增进了对PPD-Qs环境毒性的理解，并提供了一个用于长期水生毒性评估的实用 in vitro 平台。
