整合人类胚胎参考图谱系统评估类囊胚模型的转录组保真度

《Cell Systems》：Systematic transcriptomic evaluation of blastoid models of early human development

近期，能够重现人类囊胚（blastocyst）结构和细胞组成的干细胞来源类囊胚（blastoids）的产生，为阐明早期人类发育生物学提供了一种实验模型。为了评估类囊胚在模拟人类囊胚方面的保真度（fidelity），研究人员首先通过整合和整理在培养中一系列发育时间点分析的离体（ex vivo）囊胚的单细胞转录组（single-cell transcriptome）数据，建立了人类囊胚细胞身份（cell identity）和谱系分化（lineage differentiation）的参考图谱（reference map）。随后，研究人员使用该参考图谱评估了由不同细胞来源（cellular sources）和方案（protocols）产生的各种类囊胚模型的细胞谱系覆盖度（coverage）、真实性（authenticity）以及谱系分化进展（progression）。本研究产生的参考图谱能够对类囊胚进行基准评估（benchmarking），从而可能指导方案优化，以生成忠实重现自然人类囊胚的高保真类囊胚模型。

早期人类胚胎发育研究从囊胚形成到原肠运动受到技术挑战和伦理问题的限制。干细胞来源的类囊胚（blastoids）能够模拟人类囊胚的形态和细胞组成，为研究早期人类胚胎发生生物学提供了途径。目前已开发出多种方案，从不同细胞来源生成人类类囊胚，例如重编程胚胎干细胞（ESC）来源的幼稚多能干细胞（PSC）、扩展多能干细胞（EPSC）或成纤维细胞重编程的诱导多能干细胞（iPSC）。然而，不同方案生成类囊胚的效率不同，且类囊胚在培养中的发育程度有限，这引发了对这些类囊胚是否可作为人类囊胚高保真模型的保留意见。因此，建立系统评估框架以评估类囊胚模拟人类囊胚的保真度，对于提高干细胞来源胚胎模型（SCBEMs）的质量至关重要。研究人员基于初始基准评估工作，开发了计算工作流程，系统评估当前最先进方案生成的类囊胚在多大程度上重现人类囊胚细胞状态和发育特征。研究人员首先通过整合来自人类胚胎的单细胞转录组学数据，生成发育中人类囊胚细胞谱系和遗传程序的综合细胞身份参考图谱，这些数据涵盖离体囊胚的围植入期发育，从受精后4天（4 dpf；胚胎日4 [E4]）到培养中相当于12 dpf（E12）的扩展着床后阶段，以及来自Carnegie stage 7人类原肠胚（16–19 dpf；E16–E19）的体内单细胞转录组学数据。该参考图谱为跨多个互补维度基准评估类囊胚保真度提供了基础，包括分配至胚胎参考状态的置信度、囊胚阶段发育对应性、谱系代表性和同步性，以及四种方案生成的类囊胚中谱系间结构的保留。基准评估结果显示，不同方案在重现人类囊胚的组成、发育时序和协调谱系特化方面存在显著差异，突出表明高保真SCBEMs应可重复生成适当阶段和发育协调的囊胚细胞状态。总之，该工作对当前最先进方案生成的体外培养SCBEMs的发育真实性进行了全面系统评估。研究人员开展的关键技术方法包括：单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据整合；迭代集成学习（iterative ensemble learning）与scReClassify同步细胞谱系和发育阶段注释；scClassify多尺度分类；Cepo计算细胞身份基因统计；CytoTRACE识别高发育潜能细胞；igrap构建基因调控网络；非人灵长类（NHP）胚胎数据整合。样本队列来源包括：人类胚胎数据集来自Petropoulos、Mole、Zhou、Xiang、Tyser等；非人灵长类来自cynomolgus和marmoset；类囊胚数据集来自GSE150578_H/TDM（Yu et al.）、GSE158971_EPSC（Fan et al.）、GSE171820_N2B（Yanagida et al.）、GSE177689_PALLY（Kagawa et al.）。研究结果如下：生成整合人类胚胎参考：通过迭代集成学习整合五个数据集，约20%–35%细胞需要阶段/时间标签同步，多数重标记发生在相邻时间点之间，且主要发生在E9至E12阶段。最终参考的UMAP显示三种主要谱系在不同发育时间点分离，形成连续发育轨迹；检测到五个主要细胞类型（桑椹胚、早期囊胚、上胚层、下胚层、滋养层）的特异性标志物；Cepo分析确认样本主要按细胞谱系聚类，并可按发育时间点区分。识别早期囊胚的谱系特异性发育阶段解析标志物：上胚层轨迹早期相对富集幼稚相关程序，后期显示primed/着床后和FGF相关程序增加；滋养层发育可分为早期、中期和晚期三个阶段，主要转录组变化发生在E6与E7之间以及E8与E9之间；早期模块基因包括早期滋养外胚层发育关键标志物如CDX2；晚期和部分中期基因与先前研究中的晚期基因一致；重建了围植入期滋养层基因调控网络。进一步将CTB、STB和EVT相关标志物程序叠加到滋养层参考上，显示早期和中期滋养层阶段具有相对更强的CTB相关信号，而晚期滋养层阶段显示EVT和STB相关信号增加；滋养层重新聚类解析出不同的CTB样、EVT样和STB样群体以及混合/过渡和未解析状态。人类类囊胚方案的基准评估：使用参考图谱和scClassify分类四种方案。H/TDM、N2B和PALLY方案含有高比例高置信分配细胞（约70%–85%），而EPSC类囊胚高置信细胞比例显著较低（约12%）。H/TDM、N2B和PALLY富集上胚层样细胞，滋养层和下胚层样细胞比例较低；N2B类囊胚缺乏下胚层样细胞。在E6–E9目标囊胚阶段窗口，N2B和PALLY时间保真度最高，H/TDM略低，EPSC显著降低。谱系覆盖度方面，H/TDM、PALLY和EPSC保留三个主要谱系覆盖，N2B因下胚层样细胞在E6–E9中未充分代表而缺乏覆盖。谱系同步性方面，PALLY和H/TDM较高，N2B和EPSC较低。时间分辨补充分析：对H/TDM、N2B和PALLY早期采样时间点分析，N2B和PALLY显示从相对早期向晚期囊胚样组成的清晰转变，H/TDM方案在整个过程中以晚期囊胚样状态为主；上胚层和滋养层样细胞贡献于早期和晚期囊胚样组分，下胚层样细胞主要局限于晚期囊胚样组分。H/TDM中高发育潜能细胞仅极少数映射到桑椹胚阶段参考状态（第3天3个，第6天4个，第9天没有），表明该系统中桑椹胚样转录状态罕见。谱系和发育阶段保真度：在较粗注释水平，PALLY类囊胚在三个谱系中产生最高概率细胞，H/TDM主要在上胚层和滋养层谱系产生高概率细胞，N2B未产生高置信下胚层细胞，EPSC产生高置信上胚层样细胞但通过阈值的细胞比例低。在E6–E9限制下，H/TDM和PALLY保留最强的在目标细胞身份评分，H/TDM在上胚层、下胚层和滋养层样细胞中一致高，PALLY上胚层和下胚层相似强但滋养层略低；N2B在目标上胚层身份强但总体细胞身份因下胚层阶段身份几乎缺失而降低；EPSC总体中等，上胚层和下胚层身份相对保留但滋养层阶段身份较弱。谱系间结构保留：大多数方案表现良好，H/TDM谱系间结构保留最强；限制在E6–E9细胞时，N2B因下胚层相关结构缺失而整体显著降低。与非人灵长类胚胎发育程序的相似性：整合cynomolgus和marmoset猴胚胎数据，样本按谱系来源清晰分离，与物种无关；在E6–E9限制下，PALLY和H/TDM与非人灵长类胚胎总体相似性最高，N2B和EPSC较低。总体排名：PALLY和H/TDM表现最强，但原因部分不同：PALLY在谱系覆盖、时间保真度和谱系同步性得分高，H/TDM在谱系解析细胞身份和谱系间结构方面特别强。N2B实现高时间保真度，但因缺乏下胚层样细胞而持续受罚，降低其谱系覆盖、谱系同步性、发育阶段解析细胞身份和下胚层相关跨谱系结构。EPSC总体排名最低，主要因高置信细胞比例最小，且时间保真度和同步性降低，尽管在目标囊胚阶段窗口内保留三个主要谱系，并在高置信分配细胞中显示中等目标细胞身份。这些基准指标应联合解读，每个指标捕获类囊胚保真度的不同方面。为促进资源复用，研究人员将处理后的人类胚胎参考和基准数据通过Zenodo公开，并开发了交互式Shiny应用。讨论部分指出，该研究的关键创新是生成离体胚胎参考并对分化方案生成的人类类囊胚进行基准评估，但当前框架主要在转录组水平评估保真度，因此不能单独确定发育能力，无论是着床还是扩展着床后发育，因为尚无类囊胚经过这些发育结果测试。基准框架提供类囊胚模型在转录组水平重现胚胎来源细胞状态的定量评估，适合比较模型间的分子保真度；功能发育能力是模型质量的独立互补维度，需要正交实验评估。互补基准指标旨在捕获发育保真度的不同方面，而非提供SCBEM质量的单一统一度量；指标间部分分歧本身可能具有生物学信息，反映发育时序、谱系协调、谱系身份或胚胎状态分配稳健性的差异。由于围植入期发育代表连续发育过程而非一组截然离散状态，转录组基准应解释为发育进展的结构化近似，而非胚胎身份或发育能力的确定性度量。人类类囊胚延长培养尝试很少，研究显示类囊胚附着于组织培养塑料或子宫内膜细胞单层时不能发育超过几天，需要更好模拟着床微环境的改进培养系统。进一步限制来自公开可用的离体人类胚胎数据集之间发育阶段注释的不确定性，反映研究间培养条件和发育节奏差异。为减轻这种变异，研究人员在构建人类胚胎参考时应用迭代时间重排策略，该程序保守且阶段局部，主要解决相邻发育时间点之间的差异，而非强加全局发育轨迹；但该程序导致显著重分配，尤其是在后期窗口（E10–E12），细胞常在相邻阶段间重新分配。因此，使用和不使用时间重排构建的参考图谱可能在细粒度阶段分配上不同，解读基准结果时应考虑这些差异。参考中的阶段注释来自协调后的源数据集，最好解释为用于基准评估的连续发育轨迹的时间划分，而非截然离散的生物学状态。除转录组基准外，胚胎发育的重要特征如其他组学层、空间模式和区域特异性细胞组织在当前框架中仍未完全捕获。此外，随着对多能性和胚外细胞状态的理解提高，转录组保真度的解释本身可能演变。例如，近期研究提示人类EPSCs可能在转录上比先前认为的更接近primed hPSCs，这可能部分导致EPSC衍生SCBEMs中出现羊膜样而非真正滋养外胚层样状态。更广泛地，灵长类胚胎的新兴多组学和空间单细胞研究可能改进发育状态定义、改善基准参考并阐明发育保真度和能力的分子特征。结合发育能力的直接实验研究，这些方法将扩展可用于研究人类胚胎发生的指标库，并增进对某些SCBEMs表现更好的因果机制的理解。研究结论翻译：总之，这些互补的基准评估维度提供了一种结构化的转录组评估，用于衡量类囊胚在多大程度上重现人类囊胚的关键发育特征。研究人员预计，离体胚胎参考图谱将成为未来类囊胚和其他整合干细胞来源胚胎模型（SCBEMs）基准评估的有用数据资源。