慢性高脂饮食下调Wistar大鼠下颌下腺M3毒蕈碱受体和β1肾上腺素能受体mRNA表达并改变其组织学

《Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity》：Chronic High-Fat Diet Downregulates M3 Muscarinic and β1-Adrenergic Receptor mRNA Expression and Alters Submandibular Gland Histology in Wistar Rats

　　

摘要
引言：慢性高脂饮食（high-fat diet，HFD）与代谢紊乱、炎症、氧化应激以及多个器官功能损害相关。然而，其对自主神经受体表达和下颌下腺组织学的影响仍认识不足。下颌下腺贡献65%至75%的基础唾液分泌，是唾液功能的核心。本研究旨在探讨慢性HFD暴露对Wistar大鼠下颌下腺M₃毒蕈碱受体（M₃ muscarinic receptor）和β₁肾上腺素能受体（β₁-adrenergic receptor）mRNA表达及组织学变化的影响。
方法：本实验研究采用完全随机设计。14只雄性Wistar大鼠分为两组：正常饲料对照组和HFD组，每组7只。HFD给予21周。收集下颌下腺组织，采用定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction）分析M₃毒蕈碱受体和β₁肾上腺素能受体mRNA表达。采用苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色进行组织学检查，并计算每视野平均分泌单位数。数据采用Shapiro–Wilk正态性检验，随后采用独立t检验分析。
结果：HFD组M₃毒蕈碱受体mRNA表达显著低于对照组（0.189 ± 0.057 vs 0.483 ± 0.101；p < 0.001）。HFD组β₁肾上腺素能受体mRNA表达也显著低于对照组（0.067 ± 0.031 vs 0.169 ± 0.071；p = 0.008）。组织学分析显示，HFD组每视野平均分泌单位数显著低于对照组（9.84 ± 0.654 vs 13.52 ± 2.171；p = 0.007）。
结论：慢性HFD暴露下调Wistar大鼠下颌下腺M₃毒蕈碱受体和β₁肾上腺素能受体mRNA表达，并诱导组织学改变。这些发现提示慢性HFD可能影响唾液腺结构和自主调节，为唾液功能障碍和口腔健康风险增加提供潜在基础。然而，需要纳入直接功能评估的进一步研究以确认其对唾液分泌的实际影响。
关键词：高脂饮食；下颌下腺；唾液腺功能障碍；M₃毒蕈碱受体；β₁肾上腺素能受体

高脂饮食（high-fat diet，HFD）与代谢紊乱、炎症、氧化应激及多器官功能损害相关。社会经济发展改变生活方式和饮食模式，尤其在发展中国家，饮食从高碳水化合物、低脂向低碳水化合物、较高脂肪比例转变，并常伴体力活动减少。印度尼西亚2023年健康调查显示，37.4%受访者经常摄入高脂、高胆固醇或油炸食物，18岁以上成人肥胖患病率从2018年21.8%升至2023年23.4%。高脂摄入与肥胖、胰岛素抵抗、心血管疾病和慢性低度系统性炎症相关。其生物学反应包括循环游离脂肪酸、内毒素如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及炎症介质增加，可能破坏代谢稳态并损害多个器官功能。口腔中，这些系统性改变可能影响唾液腺生理并导致唾液分泌减少，增加龋齿等口腔疾病风险；印度尼西亚龋齿患病率高达82.2%。HFD还可能通过口腔和肠道微生物组改变导致牙周组织损伤。Murphy et al 报告HFD可能影响口腔微生物组，包括拟杆菌门减少和厚壁菌门增加。Bai et al 报告HFD影响动物模型唾液和肠道微生物群多样性与组成，但肠道微生物群影响更明显。这些变化提示口腔生态失调，与包括牙周炎在内的口腔疾病相关；可能机制涉及肠道菌群失调、短链脂肪酸产生减少、LPS/TLR4通路激活、系统性和局部炎症增加及牙龈血流减少，最终加速牙周组织损伤。唾液腺通过分泌唾液维持口腔健康，支持咀嚼、吞咽、润滑、缓冲、再矿化、抗菌防御和防龋。主要唾液腺包括腮腺、下颌下腺和舌下腺，受自主神经系统调节。交感刺激主要通过β-肾上腺素能受体，包括β₁肾上腺素能受体（β₁-adrenergic receptor，β₁-AR），调节唾液蛋白分泌；副交感刺激主要通过毒蕈碱胆碱能受体，尤其是M₃毒蕈碱受体（M₃ muscarinic receptor，M₃R），调节液体和电解质分泌。因此，这些受体表达改变可能提示唾液腺功能自主调节受损。既往研究表明HFD可诱导唾液腺氧化应激、亚硝化应激、炎症和结构损伤，包括线粒体功能障碍、活性氧和活性氮产生增加、炎症细胞浸润、纤维化、血管改变和细胞内脂质积累。分子水平上，HFD暴露与炎症、氧化应激和凋亡相关基因表达改变有关，包括TNF-α、IL-2、NF-κB、SOD2、GPx、BAX和Bcl-2。然而，关于HFD对唾液分泌自主调节相关基因影响的证据仍有限。下颌下腺贡献约65–75%基础唾液分泌，是评估唾液功能变化的重要腺体。因此，研究人员评估非糖尿病HFD喂养大鼠下颌下腺中M₃R和β₁-AR mRNA表达，以提供HFD诱导代谢紊乱对唾液腺功能自主调节早期影响及其口腔健康意义的线索。

关键技术方法：实验研究采用完全随机设计。样本为来自印度尼西亚万隆PT Biofarma的雄性Wistar大鼠，共14只，6–8周龄、200–220 g，2周适应后随机分为正常饲料对照和HFD组，每组7只，HFD干预21周。收集下颌下腺，以GAPDH为参考基因，采用定量实时聚合酶链反应检测M₃R和β₁-AR mRNA表达；采用H&E染色，在400×光镜下每样本随机取5个视野计数分泌单位并求均值。用Shapiro–Wilk检验正态性，独立样本t检验比较，p<0.05为显著。伦理批准号926/UN6.KEP/EC/2025。

研究结果：
1 下颌下腺中M₃R mRNA表达：HFD组M₃R mRNA表达显著低于正常饲料（normal chow diet，NCD）组。NCD组均值0.483 ± 0.101，HFD组0.189 ± 0.057。独立样本t检验显示显著差异（p < 0.001）。表明长期HFD暴露降低Wistar大鼠下颌下腺M₃R mRNA表达。
2 下颌下腺中β₁-AR mRNA表达：HFD组β₁-AR mRNA表达显著低于NCD组。NCD组均值0.169 ± 0.071，HFD组0.067 ± 0.031。独立样本t检验显示显著差异（p = 0.008）。表明长期HFD暴露降低Wistar大鼠下颌下腺β₁-AR mRNA表达。
3 下颌下腺组织学发现：NCD组下颌下腺分泌单位呈组织良好的簇状结构，提示腺体结构相对保留；HFD组每视野分泌单位较少。NCD组每视野平均分泌单位数为13.52 ± 2.171，HFD组为9.84 ± 0.654。独立样本t检验显示显著差异（p = 0.007）。表明长期HFD暴露减少Wistar大鼠下颌下腺分泌单位数。

讨论部分总结：长期HFD暴露与M₃R和β₁-AR mRNA表达降低及下颌下腺分泌单位数减少相关。这些发现提示HFD可能通过自主受体表达和组织结构改变损害下颌下腺功能。先前发表研究显示，12周HFD暴露诱导与血脂异常一致的血脂改变，HFD组总胆固醇、甘油三酯、LDL-C高于对照，HDL-C较低，具统计学意义。虽然本研究未将血脂作为主要变量分析，但这些已发表血脂数据提示本研究所用储存生物样本来自具有HFD诱导代谢紊乱的动物。Chen et al 曾报告，8周HFD给药降低糖尿病大鼠唾液腺M₃R和β₁-AR表达。然而，该研究使用糖尿病诱导模型，难以明确观察到的变化直接由HFD暴露还是糖尿病相关并发症如高血糖和血管损伤所致。因此，需要在非糖尿病条件下评估HFD对唾液腺的直接效应。本研究在未实验诱导糖尿病的情况下出现M₃R和β₁-AR mRNA表达降低，提示慢性HFD暴露伴代谢紊乱也可能损害参与唾液分泌调节的受体。M₃R mRNA表达显著降低提示HFD暴露可能影响唾液分泌的副交感调节。M₃R是唾液腺主要毒蕈碱受体，通过副交感刺激调节唾液量和成分。唾液分泌始于乙酰胆碱与腺泡细胞表面M₃R结合，激活后刺激1,4,5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP₃）形成，诱导内质网Ca²⁺释放到胞质；细胞内Ca²⁺增加激活Ca²⁺敏感性Cl^?和K⁺通道，形成渗透梯度驱动水进入腺腔；此外，细胞内Ca²⁺增加促进水通道蛋白-5（aquaporin-5，AQP5）转位至腺泡细胞顶膜，促进水运输和唾液形成。因此，M₃R表达降低可能破坏副交感介导的液体分泌并导致唾液腺功能受损。M₃R mRNA表达降低可能与HFD诱导的氧化和亚硝化应激有关。既往研究显示，HFD暴露增加唾液腺组织氧化应激生物标志物如丙二醛（malondialdehyde，MDA）和总氧化状态，同时降低总抗氧化能力。氧化应激增加可导致脂质过氧化和膜损伤，损害受体完整性和信号传导。脂质过氧化产物包括异前列腺素可破坏膜流动性和受体功能，也可能减少神经递质释放。这些机制可能削弱副交感刺激并促进M₃R表达下调。炎症也可能参与HFD组M₃R表达降低。活性氧积累可激活炎症信号通路，包括NF-κB，导致促炎细胞因子产生增加和细胞损伤。既往研究报道，HFD喂养动物下颌下腺中p-NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-22和IFN-γ表达增加，提示炎症通路激活。促炎细胞因子可能通过减少神经末梢乙酰胆碱释放干扰副交感神经传递，从而降低M₃R刺激。长期这种刺激减少可能导致M₃R表达降低，如本研究观察到的那样。HFD还被报道降低AQP5表达，这可能进一步损害水运输和唾液分泌。除M₃R表达降低外，本研究显示HFD喂养大鼠下颌下腺β₁-AR mRNA表达显著降低，提示HFD不仅影响副交感调节，也影响参与唾液蛋白分泌的交感调节。β₁-AR表达于唾液腺腺泡细胞，通过去甲肾上腺素释放介导对交感刺激的反应。去甲肾上腺素与β-肾上腺素能受体结合，激活环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）通路，增加蛋白激酶A活性、淀粉酶分泌和短暂唾液流。该通路与唾液蛋白分泌密切相关，而M₃R介导的副交感刺激主要通过细胞内Ca²⁺信号调节液体分泌。因此，β₁-AR表达降低可能降低腺泡细胞对交感刺激的敏感性并损害唾液蛋白分泌。β₁-AR mRNA表达降低与既往显示HFD可影响唾液腺交感调节的发现一致。De Carvalho et al 报告，3个月HFD暴露降低脂联素和酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）水平，提示交感神经支配受损和肾上腺素能介导的蛋白分泌降低。Yamamoto et al 也显示HFD降低大鼠下颌下腺TH水平。由于TH是儿茶酚胺合成限速酶和交感神经活动的重要标志，TH降低可能减少儿茶酚胺合成和释放，从而削弱肾上腺素能受体刺激。HFD诱导的慢性氧化应激、亚硝化应激和炎症可能进一步导致交感活动受损和β₁-AR下调。因此，β₁-AR mRNA表达降低可能反映交感调节受损，可能导致唾液蛋白分泌减少和保护性唾液功能下降。本研究还显示HFD暴露显著降低下颌下腺每视野平均分泌单位数，表明HFD可能不仅影响唾液分泌的分子调节，还影响下颌下腺组织学结构。唾液分泌单位包括腺泡和导管结构如颗粒曲管（granular convoluted tubules，GCTs），是产生唾液和参与口腔润滑、黏膜保护及口腔稳态维持的重要蛋白的关键成分。因此，分泌单位减少可能提示腺体结构损伤，并可能导致分泌功能改变。这些组织学发现与既往报道HFD暴露后唾液腺退行性变化一致，包括腺泡细胞数量减少、空泡化、浆液颗粒减少和腺泡萎缩。本研究观察到的结构变化可能与慢性氧化应激、亚硝化应激和炎症有关。活性氧和活性氮产生增加以及NF-κB等炎症通路激活可能损伤分泌细胞并降低腺体组织维持正常结构的能力，这些过程可能促成HFD组分泌单位减少。值得注意的是，啮齿类下颌下腺含有丰富的GCTs，在H&E染色中可表现为独特的嗜酸性结构。既往研究提示HFD和肥胖触发唾液腺细胞过度脂质积累（脂肪变性），导致导管萎缩、GCTs内颗粒大小和数量减少以及氧化应激和凋亡引起的细胞结构破坏。在本研究中，观察到的显著嗜酸性结构可能代表这些GCTs或正在发生结构萎缩的改变分泌单位。然而，由于当前组织学评估仅使用H&E染色，无法明确区分这些可能性。尽管如此，慢性HFD暴露同时诱导不同腺体区室结构损伤是高度可能的。这些综合结构恶化也支持qRT-PCR结果，即HFD组M₃R和β₁-AR mRNA表达降低。M₃R表达降低提示副交感调节液体分泌受损，而β₁-AR表达降低提示交感调节蛋白分泌受损。因此，分泌单位计数减少加强了HFD暴露可能通过分子和结构改变损害下颌下腺功能的解释。总体而言，本研究结果提示长期HFD暴露可能破坏下颌下腺自主调节和组织学完整性。这些变化可能代表HFD相关唾液腺功能障碍的早期机制，并可能促进与唾液分泌减少相关的口腔健康问题易感性增加。因此，慢性HFD暴露可能通过损害唾液腺功能和降低唾液保护作用间接增加龋齿风险。本研究存在若干局限。第一，未直接评估唾液功能；因此，M₃R和β₁-AR mRNA表达降低、分泌单位计数减少与唾液分泌受损之间的关联应谨慎解释。未来研究应包括功能参数如唾液流率、唾液体积、唾液蛋白浓度、淀粉酶活性和唾液免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）水平。第二，分子研究主要关注转录水平，未进行蛋白水平验证技术（如免疫组织化学或Western blotting），也缺乏特定氧化应激和炎症生物标志物测量以全面支持所提出机制。最后，组织学观察由单一未设盲观察者（主要研究者）进行，可能引入观察偏倚。此外，本研究仅依赖H&E染色，未使用特定染色如阿尔新蓝（Alcian blue），因此难以明确区分黏液腺泡、可能改变的腺泡和其他嗜酸性结构如GCTs。未来研究应采用盲法观察、多观察者评估观察者内和观察者间可靠性，并实施经过验证的组织形态计量评分系统以提供更客观的定量评价。

结论翻译：本研究证明，与对照组相比，HFD暴露降低Wistar大鼠下颌下腺M₃R和β₁-AR mRNA表达。此外，HFD暴露与下颌下腺组织学改变相关，表现为每视野平均分泌单位数减少。这些发现提示HFD暴露可能影响唾液腺结构和自主调节，为唾液功能障碍提供潜在基础。然而，由于未直接评估唾液分泌，此功能意义应谨慎解释。未来需要纳入直接功能评估、蛋白水平验证以及互补的氧化应激和炎症生物标志物的研究，以充分证实这些机制结论。