各向异性可注射羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠水凝胶经磁取向短纤维增强用于神经组织工程

《Carbohydrate Polymer Technologies and Applications》：Anisotropic Injectable Carboxymethyl Chitosan/ Oxidized Alginate Hydrogel Reinforced with Magnetically Aligned Short Fibers for Neural Tissue Engineering

　　

摘要专业翻译 周围神经损伤仍然是一个重大的临床挑战，目前的治疗方案通常无法完全恢复神经功能。具有各向异性结构的可注射多糖基水凝胶，因其仿生特性和通过席夫碱交联形成的动态网络，为解决这一问题提供了巨大潜力。本研究利用羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan, CMC）和氧化海藻酸钠（oxidized alginate, OA）通过可逆的席夫碱交联，开发了一种原位成型复合水凝胶，使其具备可注射性并在生理条件下实现细胞友好的凝胶化。研究人员将磁性短纤维（magnetic short fibers, M.SFs）掺入水凝胶中，并在外加磁场下使其取向排列，以诱导结构各向异性。该复合水凝胶表现出理想的凝胶化时间和可调的粘弹性特性，其中取向纤维组的储能模量和损耗模量均高于随机分布纤维组。刃天青（Resazurin）检测和共聚焦活/死细胞成像表明，封装在该含有取向M.SFs的复合水凝胶中的人嗅觉外胚间充质干细胞（human olfactory ecto-mesenchymal stem cells, OE-MSCs）具有高细胞活力和增殖能力。此外，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫组织化学分析证实，这种各向异性水凝胶促进了OE-MSCs的神经分化，表现为β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标志物的上调表达。此类水凝胶提供了引导神经细胞取向排列的必要信号，使其成为神经组织工程中一个有前景的候选材料。

论文解读文章

研究背景与科学问题

天然细胞外基质（extracellular matrix, ECM）为细胞提供复杂的生物活性微环境，调控细胞的粘附、增殖和分化等行为。组织工程支架作为ECM的替代物，需具备优异的物理、化学、机械和生物学特性。水凝胶因其良好的生物相容性、柔韧性和高含水量而成为组织工程的通用平台。然而，传统水凝胶通常具有各向同性结构，难以复制体内生物组织的各向异性特征。为克服这一局限，研究者探索了电场或磁场取向、机械拉伸、静电纺丝及剪切诱导取向等多种策略，其中磁诱导自组装法因能模拟复杂组织结构、传递磁-机械刺激并促进软骨、肌腱、骨骼肌和神经等组织再生而备受关注。

植入聚合物支架需要进行外科手术，增加了治疗难度。可注射水凝胶作为一种微创、生物相容性好且结构适应性强的材料被开发出来。其原理是将低粘度聚合物溶液注入损伤区域，随后在原位转化为凝胶。羧甲基壳聚糖（CMC）由壳聚糖经羧甲基化衍生而来，相比合成聚合物具有更优的生物相容性、亲水性、可降解性和水溶性。CMC基水凝胶可调节孔隙率和降解性，其负电荷能静电螯合并局部递送阳离子生物活性因子（如生长因子），模拟天然ECM中糖胺聚糖的功能。此外，CMC还具有抗菌、抗癌、抗氧化和无细胞毒性等特性，已被应用于复合材料、水凝胶和药物递送系统。在神经再生方面，CMC可用于构建三维水凝胶包封神经干细胞，也是制作神经导管（nerve guidance conduits, NGCs）的理想材料，体外研究显示其能促进肌动蛋白丝组织、磷酸化Akt表达和施万细胞迁移，动物实验证明其再生效果可与自体移植物媲美。

海藻酸钠是一种带负电的天然多糖，具有良好的生物相容性。氧化海藻酸钠（OA）在水相环境中展现出增强的生物相容性和降解速率。已有研究表明，创新的可注射CMC-OA水凝胶在生物医学工程中具有巨大潜力，其性能受氧化程度和醛基/氨基官能团比例的影响。为进一步提升海藻酸盐水凝胶的生物学和力学性能，多种纳米结构增强材料被引入聚合物基体，例如氮化碳量子点增强OA-明胶体系、ZnO纳米颗粒增强海藻酸二醛-明胶支架等。然而，这些各向同性的增强策略虽能有效改善整体性能，却无法赋予水凝胶定向结构以再现天然神经组织的取向微环境。

水凝胶面临的一个显著挑战是需要使用交联剂来保证耐久性、理想力学性能和结构完整性，但这可能限制生物相容性并延长凝胶形成时间。CMC-OA水凝胶的优势在于可通过席夫碱反应进行交联，该反应在氨基酸和醛基之间发生，无需额外交联剂或外部触发条件，因此被视为一种细胞友好型方法，特别适用于细胞包封应用。

许多研究致力于用短纤维（short fibers, SFs）增强聚合物基体（如水凝胶）。聚ε-己内酯（poly ε-caprolactone, PCL）获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，具有生物相容性、可降解性、良好加工性、理想力学性能和结构稳定性，是制备SFs的有前景候选材料。离心纺丝技术能大批量生产纤维，避免了静电纺丝的高电压和产量限制。微切割法是制备准单分散SFs的简便高效途径。

将超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs）掺入SFs中，可在外加磁场下使磁性短纤维（M.SFs）取向排列，从而制造各向异性复合水凝胶。这种取向在凝胶化后得以保持。此外，磁性组分营造的磁性微环境可通过刺激神经营养因子分泌和激活神经元膜离子通道，加速周围神经再生进程，且远程磁驱动可实现无创的外部控制。

嗅外胚间充质干细胞（olfactory ecto-mesenchymal stem cells, OE-MSCs）存在于嗅黏膜固有层中，具有多向分化潜能，易于获取且增殖率高，能够分化为功能性神经元表型。

基于上述背景，本研究旨在开发一种可注射的原位成型各向异性水凝胶，用于包封OE-MSCs并诱导其神经分化。研究人员假设，通过OA和CMC之间的动态席夫碱交联形成的多糖水凝胶，能在避免细胞毒性交联剂的同时精确调控凝胶化行为、溶胀率、孔隙率和粘弹性。此外，在此OA-CMC网络中磁取向短纤维可诱导可控的结构和力学各向异性，并通过取向纤维相与多糖基质间的协同作用调节细胞-基质相互作用，从而促进包封OE-MSCs的取向排列、伸长和神经分化。

关键研究方法

1. 1.
   磁性短纤维（M.SFs）制备：采用离心纺丝技术，将含10%（w/w）SPIONs的30%（w/v）PCL溶液（溶剂为氯仿:DMF=80:20）在5000 rpm下纺制成连续磁性PCL纤维，再通过冰冻切片微切割法将其切成长度为25 μm的短纤维。
2. 2.
   可注射自交联水凝胶构建：分别配制20%（w/v）OA溶液和13%（w/v）CMC溶液，按OA:CMC体积比4:3混合，利用席夫碱反应在37℃下自发交联成胶。确定最优配比为20:13（凝胶时间约8分钟）。
3. 3.
   磁取向各向异性水凝胶制备：将5 mg/mL的M.SFs均匀分散于水凝胶前驱体溶液中，施加300 mT静态磁场5分钟诱导纤维取向，随后在37℃下完成凝胶化。
4. 4.
   细胞实验：将OE-MSCs以每样品1×10⁴或1×10⁵细胞密度包封于水凝胶中，在标准培养条件下培养，不使用神经分化条件培养基。

研究结果

3.1 SPIONs表征

X射线衍射（XRD）图谱显示Fe₃O₄的特征衍射峰，对应立方尖晶石结构，晶粒尺寸约为21±5 nm。振动样品磁强计（VSM）曲线呈典型S形且无滞后环，确认其超顺磁性，饱和磁化强度为33 emu/g。场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）图像显示SPIONs呈均匀球形，平均粒径21±4 nm，与晶粒尺寸一致，表明颗粒主要为单晶。

3.2 M.SFs表征

热重分析（TGA）显示SPION负载PCL纤维在450℃时残留约10%，与初始SPION含量一致，证实成功掺入。VSM曲线无滞后环，纤维具超顺磁性，饱和磁化强度为3.3 emu/g，低于纯SPIONs，归因于纤维的高形状各向异性和非磁性聚合物基体的稀释效应。FE-SEM图像显示连续磁性PCL纤维表面光滑、均匀、无珠状缺陷，SPIONs均匀分散于纤维基质中，平均直径为1052±482 nm。

3.3 磁性复合水凝胶表征

凝胶化时间随OA浓度增加而缩短，OA:CMC比为20:13时凝胶时间为484±18秒（约8分钟），被认为是兼顾结构稳定性和临床操作窗口的最优配方。FE-SEM显示水凝胶具有高度多孔结构，孔隙均匀分布。光学显微照片显示，未加磁场时M.SFs随机排列；施加300 mT侧向磁场后，纤维沿磁场方向平行排列。角偏差（angular deflection, AD）测量表明，5 mg/mL M.SFs浓度下AD最小（5.3±1.9°），取向度最高，因此选定该浓度制备各向异性水凝胶。含M.SFs的水凝胶同样呈现高度多孔结构，有利于细胞浸润和物质交换。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了CMC和OA的特征吸收峰，以及水凝胶中席夫碱键的形成。

总结与结论

本研究成功开发了一种可注射、原位成型的各向异性复合水凝胶，由羧甲基壳聚糖（CMC）和氧化海藻酸钠（OA）通过席夫碱交联构成基质，并嵌入经磁场取向的磁性短纤维（M.SFs）。该体系解决了现有可注射水凝胶在结构各向异性、生物活性和操作窗口之间的矛盾。研究结果表明，该水凝胶具有适宜的凝胶化时间、可调的粘弹性以及高孔隙率。取向纤维组的储能模量和损耗模量均高于随机纤维组。细胞实验证实，包封于取向M.SFs复合水凝胶中的人嗅外胚间充质干细胞（OE-MSCs）保持了高活力和增殖能力。更重要的是，基因表达（RT-qPCR）和免疫组织化学分析显示，这种各向异性水凝胶显著促进了OE-MSCs向神经谱系的分化，表现为β-微管蛋白III（β-Tubulin III）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）标志物的上调表达。

研究结论：该各向异性水凝胶能够提供必要的信号引导神经细胞取向排列，使其成为神经组织工程中一个有前景的候选材料，尤其适用于周围神经损伤的修复。