壳寡糖与姜黄素共组装提高其生物利用度的研究

《Current Research in Food Science》：Co-assembly of Highly Active Chitosan Oligosaccharide with Curcumin to Improve Its Bioavailability

　　

姜黄素（curcumin, CCM）是一种源自姜黄的具有多种生物活性的多功能生物活性化合物。然而，其极低的水溶性导致体内代谢迅速和生物利用度差，极大地限制了实际应用。因此，开发一种能够同时实现高CCM负载量并显著提高其水溶性和生物利用度的简便高效递送系统仍是一项重大挑战。在本研究中，研究人员将壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）与CCM通过共组装方式构建了COS-CCM纳米颗粒，该过程简单、高效且环境友好。所获得的COS-CCM纳米颗粒的药物负载量（drug loading content, DLC）为41.56%，包封率（encapsulation efficiency, EE）为76.73%。与游离CCM相比，CCM的水溶性提高了约1100倍。此外，在模拟胃肠条件下，COS-CCM纳米颗粒的释放曲线下面积（AUC）比游离CCM高出15倍以上，表明其胃肠道释放性能显著改善。这些发现表明，寡糖与疏水性生物活性化合物的共组装提供了一种简单有效的策略，用于克服水溶性差和生物利用度低的限制，同时保持高负载能力。该策略可能拓宽寡糖作为功能性纳米载体的应用，并为构建用于营养素递送和疾病治疗的共组装递送系统提供新的可能性。

一、研究背景、现存问题与研究意义

姜黄素（curcumin, CCM）作为一种从姜黄中提取的天然多酚类化合物，因其抗炎、抗氧化、抗菌、抗增殖及抗肿瘤等多种生物活性而备受关注。尽管人体I期临床试验显示其在高达12克/天的高口服剂量下仍然安全，但CCM极低的水溶性、有限的胃肠道溶解性以及快速的体内代谢，导致了其极差的生物利用度，严重制约了其在功能食品和营养保健品领域的有效应用。为解决这一问题，研究者们开发了多种递送策略，包括基于脂质、合成聚合物、蛋白质和碳水化合物的纳米递送系统。其中，碳水化合物基纳米载体因具有良好的生物降解性、生物相容性、结构多样性和可持续性而受到青睐。然而，现有系统通常难以实现对CCM等疏水性化合物的高负载量，传统系统的CCM负载量通常仅为10%-15%。壳聚糖是一种天然阳离子多糖，但其高分子量和有限的水溶性限制了其在水相体系中的应用。壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）是壳聚糖的解聚产物，具有较低的分子量和改善的水溶性，同时保留了壳聚糖的良好生物学特性。本研究旨在探究高度亲水的COS能否通过与疏水性CCM直接共组装，同时充当结构组分和亲水性载体，以实现高负载量和改善的CCM水分散性，从而为克服疏水性植物化学物质的利用瓶颈提供新的思路。

二、研究内容与结论

研究人员成功构建了COS-CCM纳米颗粒，通过共组装方式实现了对CCM的高效负载。实验结果表明，该纳米颗粒的药物负载量（DLC）达到41.56%，包封率（EE）为76.73%。与游离CCM相比，CCM的表观水溶性提高了约1100倍。在模拟胃肠条件下，COS-CCM纳米颗粒的释放曲线下面积（AUC）比游离CCM高出15倍以上，显示出显著改善的胃肠道释放性能。细胞实验中，COS-CCM纳米颗粒在4T1细胞中的半数抑制浓度（IC₅₀）从游离CCM的20.64微克/毫升降至10.54微克/毫升，表明其抗增殖效力增强。在乳腺癌肿瘤治疗模型中，相对抑瘤率从58%提升至73%。这些发现证明了寡糖介导的共组装策略在改善疏水性生物活性化合物的理化性质和生物学性能方面具有重要潜力。

三、主要关键技术方法

1. 1.
   COS-CCM纳米颗粒的制备：将CCM的二甲基亚砜（DMSO）溶液滴加到COS的水溶液中，在室温下磁力搅拌进行共组装形成纳米颗粒。
2. 2.
   表征技术：
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     粒径与表面电荷测定：采用动态光散射（DLS）和Zeta电位分析仪测量纳米颗粒的粒径分布、多分散指数（PDI）及表面电荷。
   • •
     形貌观察：使用扫描电子显微镜（SEM）观察纳米颗粒的表面形貌。
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     光谱分析：利用紫外（UV）吸收光谱和红外（IR）光谱分析分子间相互作用力。
   • •
     接触角分析：测量材料表面的亲疏水性。
3. 3.
   分子动力学模拟：使用Materials Studio软件模拟COS与CCM之间的分子间相互作用，如氢键和疏水作用。
4. 4.
   体外评价：
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     药物负载量与包封率：采用高效液相色谱法（HPLC）测定。
   • •
     体外释放：在不同pH值（7.4, 6.7, 5.6）的磷酸盐缓冲液（PBS）和模拟胃肠液（SGF和SIF）中进行。
   • •
     细胞摄取与细胞毒性：使用荧光倒置显微镜观察4T1细胞的摄取情况；采用MTT法评估细胞活力并计算IC₅₀值。
5. 5.
   体内评价：在雌性BALB/C荷瘤小鼠模型中，通过尾静脉注射给药，评估纳米颗粒的体内分布、抗肿瘤效果及生物安全性。

四、研究结果

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  COS-CCM纳米颗粒的制备与形貌调控
  研究人员首先筛选了多种糖类，发现只有COS能与CCM形成具有共组装形态的纳米复合物。初始形成的颗粒尺寸约为1微米。通过添加碳酸钠（Na₂CO₃）作为无机电解质调节纳米颗粒团聚，成功将粒径减小至约200纳米。所得纳米颗粒呈规则球形，表面带负电，Zeta电位约为-22.70毫伏。接触角实验证实，与游离CCM相比，COS-CCM纳米颗粒的表面亲水性显著提高。
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  COS与CCM相互作用的表征
  通过紫外光谱、红外光谱和分子动力学模拟，研究人员揭示了COS与CCM之间的主要相互作用力为氢键和疏水相互作用。紫外光谱中观察到红移现象，表明氢键作用的存在；加入十二烷基硫酸钠（SDS）后发生蓝移，证实了疏水相互作用。红外光谱显示COS-CCM纳米颗粒的特征吸收峰发生了位移，进一步验证了分子间的相互作用。分子动力学模拟也证实了COS（主要为壳四糖）与CCM之间存在强氢键。
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  增强的CCM水分散性与生物相容性
  溶血实验表明，所有测试浓度的COS-CCM纳米颗粒的溶血率均低于5%，显示出优异的血液相容性。表观水溶性测试结果显示，游离CCM的水溶性极低（0.0923%），而COS-CCM纳米颗粒中CCM的表观水溶性达到了99.87%，提高了约1100倍。在模拟胃肠条件下的释放实验中，COS-CCM纳米颗粒的累积释放量和AUC均远高于游离CCM，表明其胃肠道可利用性显著提升。
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  体外释放行为
  在pH 7.4、6.7和5.6三种不同pH条件下，COS-CCM纳米颗粒在12小时内的累积释放率分别约为31%、33%和45%，表现出缓慢且持续的释放特性。这种缓释行为归因于CCM与COS之间的强相互作用。纳米颗粒在酸性环境中相对更稳定，这可能与颗粒表面氨基酸向外取向形成的负电荷有关。
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  细胞实验
  MTT实验结果显示，COS-CCM纳米颗粒在4T1细胞中的IC₅₀值为10.54微克/毫升，显著低于游离CCM（20.64微克/毫升）和单独COS（30.08微克/毫升），表明其抗增殖活性提高了约1.96倍。在MCF-7细胞中也观察到类似的增效作用，IC₅₀从游离CCM的16.96微克/毫升降至1.33微克/毫升。联合指数（CI）分别为0.81和0.78，提示COS与CCM之间存在协同作用。细胞周期分析表明，COS-CCM纳米颗粒处理导致更多的细胞阻滞在G2/M期（46.33%），而G0/G1期细胞比例显著降低（0.18%）。细胞摄取实验显示，COS-CCM纳米颗粒能够被4T1细胞有效摄取，且荧光强度随时间增加。
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  体内抗肿瘤活性评价
  体内分布实验显示，FITC标记的COS-CCM纳米颗粒经尾静脉注射后，能快速分布于肝脏、肾脏和肿瘤组织，并在肿瘤组织中持续富集，这主要得益于增强渗透与滞留效应（EPR）。体内抗肿瘤实验结果显示，经过12天治疗后，COS-CCM纳米颗粒组的平均肿瘤体积显著小于游离CCM组和COS组，相对抑瘤率达到14.7%（原文此处数据表述可能存在歧义，但总体结论为COS-CCM纳米颗粒表现出更优的抗肿瘤疗效）。
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  生物安全性评估
  体重监测和血液生化指标检测（包括丙氨酸氨基转移酶ALT、天冬氨酸氨基转移酶AST等肝肾功能指标）以及各组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色结果均表明，COS-CCM纳米颗粒未引起显著的全身毒性或器官损伤，具有良好的生物安全性。

五、总结与讨论

本研究成功建立了一种简便的碳水化合物介导的共组装策略，利用低聚合度的壳寡糖（COS）与姜黄素（CCM）主要通过氢键和疏水相互作用形成共组装纳米颗粒。该策略实现了41.56%的高药物负载量（DLC）和76.73%的包封率（EE）。亲水性COS外壳显著改善了CCM的水分散性，使其水溶性提高了约1100倍。在模拟胃肠条件下，COS-CCM纳米颗粒的释放AUC比游离CCM高出15倍以上，展现出增强的胃肠道释放性能。细胞实验证实，COS-CCM纳米颗粒增强了CCM的抗增殖效力，在4T1细胞中将IC₅₀从20.64微克/毫升降至10.54微克/毫升。在乳腺癌肿瘤治疗应用中，相对抑瘤率从58%提升至73%。这些发现共同建立了COS分子特性、碳水化合物介导的共组装、纳米颗粒形成与CCM理化和生物学性能改善之间的关系。该策略凸显了碳水化合物基纳米结构在功能食品和营养保健品领域中递送难溶性植物化学物质的巨大潜力。