纳米赋能妊娠检测试纸渗滤液中纳米金(nAu)释放及其对斑马鱼（Danio rerio）早期发育和视运动反应(OKR)的毒性

《Environmental Pollution》：From diagnostic device to environmental contaminant: Leachate release from nano-enabled pregnancy tests and associated toxicity during early development stages of zebrafish ( Danio rerio)

　　

侧向层析检测（lateral flow assays, LFA）装置是水生污染中被忽视的来源，可在水环境中产生含纳米金（nanogold, nAu）的复杂化学渗滤液。试纸设计与配方影响纳米金（nAu）释放和渗滤液毒性。共释放化学物质可能改变纳米金（nAu）行为与生物学效应。渗滤液干扰斑马鱼发育和视运动反应（optokinetic response, OKR）。在安全设计策略中应考虑装置组成。

一次性侧向层析检测（lateral flow assays, LFA）装置包括妊娠检测试纸、SARS-CoV-2检测试纸、HIV检测试纸等即时诊断装置，因快速、廉价且易于判读而在全球大量使用。其广泛使用导致不可生物降解塑料废物持续进入市政废物流和填埋场。LFA除可能释放工程纳米材料（engineered nanomaterials, ENMs），如纳米金（nanogold, nAu），还含抗体、防腐剂、表面活性剂和聚合物，这些组分在装置于填埋条件下降解时可形成复杂渗滤液。LFA利用毛细力运输液体样品，样品经样品垫进入含nAu-抗体偶联物的结合垫，再迁移至硝酸纤维素测试区，捕获抗体固定抗原结合复合物，nAu的表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）产生可见色线。功能化ENMs仍嵌入装置中，处置后常进入填埋场。除nAu-抗体偶联物外，LFA还含聚合物背衬、硝酸纤维素膜、纤维素基垫、粘合剂和稳定剂。这些组件在使用后暴露于环境条件，可能释放ENMs以及防腐剂、塑料组分和其他试纸相关材料。因此，废弃LFA应被视为含功能化ENMs的复杂化学混合物来源，而非孤立ENMs来源。释放后nAu和共释放化学品可能发生多种转化，其毒性依赖ENMs尺寸、形状、聚集状态及与生物系统的相互作用；常规毒性测试难以捕捉纳米毒性复杂性。单次使用妊娠检测试剂盒的环境影响仍不清楚，且新兴证据提示其可能释放nAu及防腐剂等添加剂。斑马鱼胚胎因易操作、繁殖快、与哺乳动物基因同源且幼虫透明，被用于发育毒性和毒性机制评估。既往研究显示，表征明确的孤立nAu可影响斑马鱼眼部发育，但化学复杂渗滤液是否产生类似效应尚不清楚。因此，研究人员旨在确定两种妊娠检测试纸在模拟填埋条件下是否释放nAu和其他共释放化学品，并以鱼胚毒性试验（fish embryo toxicity test, FET；OECD TG 236）和OKR试验评估全渗滤液对斑马鱼胚胎的发育与神经行为毒性。模拟填埋条件包括环境温度和升高温度、降低氧可用性及延长孵育时间。

在方法上，研究人员采用两种市售妊娠检测试纸品牌（Type A和Type B，制造于中国并分别在南非和挪威销售；每品牌n=50，购自当地药店）。去除外壳后，以MilliQ水或E3胚胎培养基，在28°C、50°C、氮气低氧和15 h等模拟填埋条件下制备未使用与使用后全渗滤液。采用UV-Vis、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）、zeta电位、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）与能量色散X射线光谱（energy-dispersive X-ray spectroscopy, EDS）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（attenuated total reflectance Fourier-transform infrared spectroscopy, ATR-FTIR）和Bradford法表征。斑马鱼来源为University of Stavanger（Norway）的野生型AB系，按OECD TG 236进行FET，并在96 hpf对PB(used)存活幼虫进行OKR评估。

结果部分按原文小标题总结如下。

1. 表征（Characterisation）
1.1. UV-Vis光谱（UV-Vis spectroscopy）：通过200–800 nm UV-Vis分析，PA和PB光谱总体吸收模式相似但强度不同。光谱在300 nm以下强吸收，260–280 nm峰与蛋白质存在一致，NaN₃在约230–250 nm有吸收峰，520–550 nm宽峰对应nAu的SPR，证实nAu-抗体偶联物可浸出，但释放程度随使用前后和制造商不同。PA(unused)峰强度较高，提示释放更多化学品；PB(unused)强度较低，提示浸出较少。PB(used)经15 h孵育后总体峰强度更高，PA(used)则未同样升高，但仍可见小SPR峰。在模拟填埋条件下，PA(used)在低氧与高温组合下SPR峰强度增加；PB(used)未出现SPR峰。PA(used)在300 nm以下吸收强于PB(used)，提示Type A试纸更可能向环境释放化学品。

1.2. 动态光散射与zeta电位（Dynamic light scattering and zeta potential）：DLS显示PA(unused)和PB(unused)流体动力学尺寸相近，分别为62.8 nm和69.9 nm，表面带负电。PA(used)流体动力学尺寸增至537.2 nm，zeta电位接近中性；PB(used)为92.7 nm，zeta电位也接近中性。使用后试纸渗滤液电导率高于未使用试纸，zeta电位降低，提示模拟使用后胶体稳定性下降并可能促进聚集。PA(used)尺寸显著大于PB(used)，提示释放nAu与试纸相关有机组分之间可能发生异聚集。PA(used)多分散指数（polydispersity index, PDI）高于PA(unused)，PB(used) PDI低于PB(unused)。

1.3. ATR-FTIR：ATR-FTIR显示试纸沿长度组成不同，主要贡献来自粘合剂、塑料、增塑剂、邻苯二甲酸酯以及背衬中的玻璃/硅基材料。测试区中聚酯和纤维素显著，吸收垫主要由纤维素基材料如纸和甲基纤维素组成。基于光谱库匹配的暂定鉴定还包括马来酸酐共聚物、二氧化钛和若干金属硫酸盐（MgSO₄、CuSO₄、ZnSO₄），但这些并非最高化学评分。Type A试纸匹配条目多达190个，Type B为185个，其中65个化学信号在两类中共同存在，提示塑料、粘合剂和稳定剂存在共享骨架，添加剂和增塑剂存在差异。Type B试纸显示塑料的UV和热降解光谱特征，Type A未观察到。

1.4. 电子显微镜与X射线光谱（Electron microscopy and X-ray spectroscopy）：SEM-EDS确认使用后Type A试纸测试区存在nAu。TEM显示PA(used)颗粒范围为3.7–19.9 nm，平均直径8.2 ± 2.9 nm，多为球形；PB(used)颗粒范围为1.3–12.8 nm，平均直径4.5 ± 2.0 nm。Mann-Whitney U检验表明PB(used)颗粒显著小于PA(used)（p < 0.001）。尽管未进行TEM-EDS，但结合试纸SEM-EDS和UV-Vis中特征性SPR峰，支持这些颗粒为nAu。

1.5. 蛋白质定量（Protein quantification）：Bradford法显示，最高蛋白浓度见于PA(unused)，为121.74 ± 32.8 μg mL^-1；最低见于PB(used)，为49.9 ± 5.95 μg mL^-1。对Type A和Type B，使用后试纸渗滤液的蛋白平均浓度均低于未使用试纸。

2. 鱼胚毒性试验与视运动反应评估（Fish embryo toxicity tests and optokinetic response (OKR) assessment）
FET显示制造商依赖性发育毒性。暴露于PA(used)后，除12.5%渗滤液和100%渗滤液外，多数暴露组在最初24 h出现广泛凝血。100%组部分胚胎相对阴性对照和其他暴露组出现发育延迟，但发生率无统计学显著性。48 hpf时，几乎所有剩余胚胎出现心包水肿，部分胚胎存在多种异常。这些水肿在72 hpf多已消退，但100%组72 hpf患病率为76%，96 hpf为47%。100%组运动减少发生率最高，96 hpf畸形发生率最高，47%存活幼虫同时具有心包水肿和卵黄囊水肿。该组还显示发育延迟：24 hpf时29%尚未形成体节，48 hpf时86%胚胎色素延迟。阳性对照1.4 g L^-1 NaN₃组也观察到色素延迟。0.02% NaN₃暴露组24 h后存活率为0%。PA(used)与胚胎绒毛膜（chorion）相互作用，在绒毛膜表面形成沉积物，最高浓度组最明显，PB(used) FET中未观察到。PB(used)发育毒性明显较低：48 hpf时各浓度均出现水肿，6.25%渗滤液组患病率最高为50%，但72 hpf时已消退；72 hpf时无胚胎出现异常；96 hpf时仅100%渗滤液组显示视觉上严重的运动减少。将严重运动减少作为额外致死终点后计算LC值：标准OECD终点下，PA(used)的LC₁₀为1:55，LC₂₀为1:10，LC₅₀超过最高测试浓度；PB(used)未达到。纳入严重运动减少后，PB(used)的LC₁₀、LC₂₀、LC₅₀分别为1:71、1:39、1:12；PA(used)的LC₁₀为1:32。由于PA(used)死亡率高，OKR仅对PB(used) FET剩余幼虫进行。PB(used)各组存活率为90–100%，足以满足重复要求。25%、75%和100%渗滤液组幼虫OKR显著降低，50%组也低于对照但未达显著。幼虫表现为延迟追踪、不完整眼动，扫视频率减少且幅度降低，提示剂量依赖性视觉运动功能破坏。

讨论部分总结：全球每年分发超过3.7亿妊娠检测试剂盒。理解这些装置处置后渗滤液化学性质对环境风险评估重要。渗滤液表征可揭示释放ENMs的尺寸、聚集状态、稳定性和化学组成，以及共释放化学品对ENM行为的潜在影响。PA(used)在300 nm以下吸收较强，与NaN₃和其他在此区域吸收的有机添加剂一致。DLS显示大流体动力学尺寸和高PDI，提示nAu广泛聚集，可能由表面活性剂或稳定剂改变nAu表面、渗滤液中碎片增加光散射以及zeta电位中和驱动。盐和缓冲组分释放可使颗粒更易与生物表面作用，形成绒毛膜沉积。FET显示毒性可能依制造商而异：PA(used)在多数浓度下早期引起广泛凝血，100%组出现非显著发育延迟；NaN₃阳性对照也延迟斑马鱼发育和色素。未纳入运动减少前无可测LC值，提示存在不立即致死的亚致死效应。nAu与生物分子相互作用可能引起氧化还原反应，加之nAu类氧化酶活性和活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成能力，可能导致发育斑马鱼氧化应激。研究采用实验室模型，可能代表最坏暴露情景；自然环境中nAu和其他试纸相关化学品释放可能更渐进，并受稀释、风化和微生物降解影响。当前环境浓度未知，且本研究未定量金释放，ICP-MS分析仍在进行。尚无已发表的源于废弃LFA装置的填埋渗滤液或受纳水体中nAu浓度估计。因此，该研究应解释为危害识别而非定量环境风险评估；但考虑到每年大量妊娠检测试剂盒进入废物流，以及纳米赋能LFA装置处置时可释放nAu的证据，这些发现提示需要环境监测和未来定量研究。负电nAu颗粒被正电绒毛膜蛋白隔离可减少颗粒进入发育胚胎并降低毒理效应；本研究中绒毛膜上紫色沉积与nAu在静电作用驱动下聚集于绒毛膜表面一致。ATR-FTIR库匹配提示Type A试纸可能存在马来酸酐相关共聚物，但该信号并非主导，不能直接证明这些聚合物参与观察到的聚集。球形nAu聚集可诱导表面等离子耦合，导致红移呈紫色。尽管可能存在绒毛膜隔离机制，PA(used)总体毒性更高，可能因非层压Type A试纸释放更多总nAu，超过绒毛膜结合容量。绒毛膜上的聚集物也可能堵塞允许气体和离子交换的绒毛膜孔，导致缺氧和渗透胁迫，但该机制需进一步研究。相较之下，PB(used)尺寸更小、PDI更低，反映因塑料层压膜而减少nAu释放，与较低毒性和无紫色绒毛膜沉积相关。尽管PB(used)发育效应减少，OKR试验提供神经毒性证据，暴露幼虫扫视眼动频率显著降低，提示视觉运动功能受损。该发现与nAu干扰斑马鱼眼发育和色素、导致神经行为效应的结果一致；但渗滤液中其他化合物也可能贡献这些效应。表面活性剂可增加nAu环境危害，提高其摄取和/或毒性；较小nAu常与更强毒理效应相关。PB(used)虽产生较少发育效应，但OKR结果显示神经发育效应可在无明显发育毒性下被诱导。

研究结论翻译：本研究表明，全球制造、销售和丢弃的一次性妊娠检测试剂盒可在水生环境中作为化学复杂渗滤液的潜在来源，这些渗滤液含ENMs、防腐剂、表面活性剂、增塑剂和塑料颗粒。这些全渗滤液能够诱导斑马鱼胚胎的发育毒性和神经行为毒性，制造商之间配方差异可能强烈影响渗滤液组成和毒性。由于渗滤液是作为复杂混合物评估的，所观察到的发育效应不能仅归因于nAu，这突出表明需要考虑共释放污染物之间的相互作用。这些发现强调，需要将丢弃的即时诊断装置视为废物流中新出现污染物的潜在来源，也需要开发安全且可持续设计（safe and sustainable-by-design）的纳米赋能装置。此外，该研究强调未来研究需要识别和量化导致这些化学复杂渗滤液毒性的各个组分。