《Food Bioscience》：Liposomal Encapsulation of Hardy Kiwi (
Actinidia arguta) Bioactives: Optimization, Characterization and Biological Screening in Physiological Barrier Models
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天然来源的生物活性化合物因其广泛的生物活性以及在制药、营养保健品和化妆品领域的潜在应用而引起了科学界和工业界的极大兴趣。其中，硬皮猕猴桃（Actinidia arguta）果实作为一种突出但仍未被充分开发的生物活性化合物来源而备受关注。然而，此类植物来源生物活
天然来源的生物活性化合物因其广泛的生物活性以及在制药、营养保健品和化妆品领域的潜在应用而引起了科学界和工业界的极大兴趣。其中，硬皮猕猴桃（Actinidia arguta）果实作为一种突出但仍未被充分开发的生物活性化合物来源而备受关注。然而，此类植物来源生物活性化合物的实际应用常受限于其固有的理化不稳定性、对氧化和热降解的敏感性，以及跨生理屏障的有限渗透性。本研究旨在优化负载硬皮猕猴桃果实提取物的脂质体，并通过整合处方优化、植物化学表征以及采用代表肠道、内皮、皮肤和癌症相关屏障的细胞模型进行生物学筛选，为其作为未来屏障特异性应用的纳米递送系统提供初步评估。采用中心复合设计（CCD）结合响应面法（RSM）对脂质体处方进行优化，以囊泡粒径（VS）、多分散指数（PDI）和包封效率（EE）作为响应变量。优化后的脂质体表现出纳米级粒径（107.2 nm）、低多分散指数（0.173）及高胶体稳定性，Zeta电位（ZP）在-47.8至-53.0 mV之间。通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间-电喷雾电离-质谱联用（UPLC-QTOF-ESI-MS）分析，在脂质体中鉴定出15种主要酚类化合物，包括6种酚酸和9种黄酮类化合物。基于质谱定量分析，优化处方的包封效率为50.73%。差示扫描量热法（DSC）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和透射电子显微镜（TEM）证实了结构完整性和提取物-脂质相容性。在体外细胞毒性评价中，负载硬皮猕猴桃的脂质体在多种生理屏障细胞模型中表现出良好的生物相容性，且脂质体包封降低了脂质相关的毒性。研究结果表明，优化后的硬皮猕猴桃脂质体是一种具有前景的纳米递送系统，可用于未来屏障特异性应用。
论文解读
一、研究背景与意义
天然来源的生物活性化合物因其广泛的生物活性以及在制药、营养保健品和化妆品领域的应用潜力而受到科学界和工业界的极大关注。果实来源的提取物富含酚类化合物、黄酮类、维生素和有机酸，具有优异的抗氧化、抗炎、抗菌和细胞保护特性。其中，硬皮猕猴桃（Actinidia arguta）果实，俗称硬皮猕猴桃或婴儿猕猴桃，已被证明含有高水平的酚酸、黄酮类、维生素及其他生物活性化合物，并具有抗氧化、抗炎和抗癌等特性。然而，尽管关于硬皮猕猴桃植物化学组成和生物学潜力的证据日益增多，针对能够保护这些化合物并增强其与生物屏障相互作用的递送系统的开发却鲜有关注。植物来源生物活性化合物的实际应用常受限于其固有的理化不稳定性、对氧化和热降解的敏感性，以及跨生理屏障的有限渗透性。纳米技术递送系统已成为克服这些限制的有效工具，其中脂质体因其独特的结构和功能特性而被广泛研究。脂质体由包裹水性核心的磷脂双分子层组成，具有天然生物相容性和可生物降解性，其结构允许同时包封亲水性和亲脂性化合物。尽管已有研究报道将富含酚类的植物提取物包封于脂质体中，但关于这些系统与未来生物医学应用相关的生理屏障相互作用的关注仍然不足。此外，据研究人员所知，此前尚无研究优化并表征专门含有硬皮猕猴桃果实提取物的脂质体制剂，并同时在多种生理屏障模型中评估其生物学响应。因此，本研究旨在优化硬皮猕猴桃果实提取物负载脂质体，并通过整合处方优化、植物化学表征和生物学筛选，为其作为未来屏障特异性应用的纳米递送系统提供初步评估。
二、主要技术方法
研究人员采用超声辅助提取（UAE）技术从硬皮猕猴桃果实中制备提取物，使用水醇溶剂（50% H?O:50% EtOH）在室温下提取17.5分钟。脂质体制剂采用超声法制备，并通过响应面法（RSM）结合中心复合设计（CCD）优化，以卵磷脂浓度、提取物浓度和超声振幅作为独立变量，囊泡粒径（VS）、多分散指数（PDI）和包封效率（EE）作为响应变量。表征手段包括动态光散射和电泳光散射测定粒径和Zeta电位、超高效液相色谱-四极杆飞行时间-电喷雾电离-质谱联用（UPLC-QTOF-ESI-MS）分析植物化学组成、透射电子显微镜（TEM）观察形态、差示扫描量热法（DSC）分析热行为、傅里叶变换红外光谱（FTIR）评估分子间相互作用。体外细胞毒性采用MTT法，在代表不同生理屏障的七种细胞系中进行评价，包括人角质形成细胞（HaCaT）、人真皮成纤维细胞（HDFa）、人恶性黑色素瘤细胞（A375）、人胶质母细胞瘤细胞（U251）、人肠道上皮细胞（Caco-2和HT29-MTX）以及小鼠脑内皮细胞（bEnd.3）。
三、研究结果
1. 中心复合设计结果
CCD共进行了16次随机化实验，脂质体的VS介于96.3至442.6 nm之间，PDI介于0.154至0.450之间，EE介于49.7%至79.7%之间。方差分析（ANOVA）表明，VS模型的决定系数R2为94.29%，PDI模型的R2为96.25%，EE模型的R2为86.27%，均表现出良好的拟合度且失拟项不显著（p > 0.05），证实了二次模型的适用性。
2. 中心复合设计分析
在VS方面，提取物浓度（p = 0.0084）和超声振幅（p = 0.0154）均显著影响囊泡粒径，提取物浓度增加导致囊泡增大，这归因于溶质掺入脂质双分子层后内部水相体积增加或囊泡聚集。超声振幅与卵磷脂浓度的交互作用（AC，p = 0.0377）以及提取物浓度与超声振幅的交互作用（BC，p = 0.0145）也显著影响VS。在PDI方面，提取物浓度（p = 0.0297）和超声振幅（p = 0.0344）均显著影响粒径分布均匀性，偏离中等提取物浓度范围会导致PDI升高，过高振幅可能导致囊泡融合或破裂。在EE方面，仅提取物浓度的二次项（BB，p = 0.0443）具有统计学显著影响，表明存在非线性趋势，极端提取物浓度导致较高的EE，而中等浓度范围则有利于较低包封。
3. 中心复合设计验证与多响应优化
通过期望函数法确定预测最优条件为卵磷脂浓度168 mg/mL、提取物浓度42.5 mg/mL、超声振幅29%（R2 = 0.995）。在此条件下制备的脂质体实验值分别为VS 107.2 ± 5.2 nm、PDI 0.173 ± 0.011、EE 68.9 ± 3.5%，与预测值的变异系数（CV）分别为7.56%、6.29%和4.15%，均低于10%，验证了模型预测的可靠性。
4. 脂质体制剂表征
植物化学分析通过UPLC-QTOF-ESI-MS鉴定出负载脂质体中含有15种主要酚类化合物，包括6种酚酸和9种黄酮类化合物。与游离提取物相比，脂质体系统保留了有限子集的化合物，主要为酚酸和黄酮糖苷。定量数据显示，槲皮素-3-O-吡喃葡萄糖苷（8.42 μg/mL）、山柰酚-7-O-吡喃葡萄糖苷（5.92 μg/mL）和绿原酸衍生物（5.07 μg/mL）是脂质体中最丰富的化合物。基于质谱定量，优化脂质体的EE约为50.73 ± 2.54%，低于基于DPPH法测得的68.9%，差异归因于两种分析方法原理不同。稳定性评估表明，制剂在4°C储存90天内保持良好的胶体稳定性，PDI保持在0.173至0.190之间，ZP在-47.8至-53.0 mV之间波动，VS在30天内从107.2 nm增至128.8 nm后保持稳定。TEM图像显示负载脂质体较空白脂质体呈现更大的粒径、更厚的膜边界和内部对比度，表明提取物成功掺入。DSC分析显示负载脂质体的热谱与空白脂质体相似，提取物的热转变被脂质基质掩盖，表明酚类与脂质酰基链或头部基团之间存在强相互作用。FTIR分析证实了提取物的成功包封，O-H伸缩带强度降低和位移表明酚羟基与脂质头部基团形成氢键相互作用，且未出现新峰，表明包封过程涉及非共价相互作用。
5. 体外细胞毒性
在Caco-2细胞中，游离提取物在低浓度（62.5-125 μg/mL）下轻微提高细胞活力，最高浓度（2000 μg/mL）下活力急剧下降；空白脂质体在1000和2000 μg/mL下表现出最显著的活力下降，负载脂质体产生中间效应，表明包封提取物部分缓解了脂质相关毒性。HT29-MTX细胞呈现类似模式。bEnd.3内皮细胞呈双相响应，低浓度下提取物和负载脂质体显著提高活力，浓度≥500 μg/mL时活力明显下降。U251胶质瘤细胞中，游离提取物在各浓度下维持接近对照的活力（p > 0.05），而负载和空白脂质体均呈剂量依赖性活力下降。皮肤屏障模型中，HaCaT和HDFa细胞对提取物和脂质体制剂表现出较好的耐受性，负载脂质体在高浓度下较空白脂质体表现出更温和的毒性效应。A375黑色素瘤细胞对游离提取物和脂质体制剂均表现出浓度依赖性响应。总体而言，负载硬皮猕猴桃的脂质体在多种生理屏障模型中表现出良好的生物相容性，且脂质体包封降低了脂质相关的毒性。
四、讨论与结论
研究结果表明，通过RSM-CCD优化的硬皮猕猴桃提取物负载脂质体具有纳米级粒径、低多分散性和高胶体稳定性，能够在90天储存期内保持关键理化特性。脂质体系统选择性保留并浓缩了特定的酚酸和黄酮糖苷，如绿原酸衍生物以及基于槲皮素和山柰酚的糖苷，这些化合物是硬皮猕猴桃抗氧化和抗肿瘤特性的重要贡献者。DSC和FTIR分析证实了提取物与脂质基质之间的非共价相互作用，确保了结构完整性和提取物-脂质相容性。体外细胞毒性评价表明，负载脂质体在代表肠道、血脑屏障、皮肤和癌症的细胞模型中表现出良好的生物相容性，且包封降低了脂质相关的毒性。研究结论认为，优化后的硬皮猕猴桃脂质体是一种有前景的纳米递送系统，可用于未来屏障特异性应用，为硬皮猕猴桃生物活性化合物的递送提供了新的策略，同时为植物来源活性成分的脂质体包封及其与生理屏障的相互作用提供了重要的科学依据。
