基于非靶向与靶向代谢组学鉴定冷藏牛肉中4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸为新型腐败生物标志物

《Food Chemistry: X》：Identification of 4-hydroxyphenethyl alcohol and 6-hydroxynicotinic acid as novel spoilage biomarkers in refrigerated beef

　　

鉴定4-羟苯乙醇（4-hydroxyphenethyl alcohol）和6-羟基烟酸（6-hydroxynicotinic acid）作为冷藏牛肉中的新型腐败生物标志物。将非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）与靶向代谢组学（targeted metabolomics）策略整合，以分析冷藏贮藏期间牛肉品质劣变过程。14种代谢物与关键新鲜度指标呈强正相关。4-羟苯乙醇（4-hydroxyphenethyl alcohol）和6-羟基烟酸（6-hydroxynicotinic acid）被鉴定为牛肉腐败的新型生物标志物。靶向定量（targeted quantification）证实两种生物标志物在关键腐败点积累。

牛肉富含优质蛋白和不饱和脂肪酸，具有较高营养和商业价值，是全球消费量最大的肉类之一。与冷冻牛肉相比，冷藏牛肉通常更能保持原有色泽、质构、风味和营养品质，满足消费者对“鲜肉”适口性和食用品质的需求。但在屠宰加工、运输、零售展示和家庭贮藏过程中，牛肉不可避免受到微生物生长和内源酶活性影响。随贮藏时间延长，蛋白质逐渐降解为肽、游离氨基酸和含氮代谢物，同时脂质氧化产生醛、酮和酸类物质，进一步导致营养价值和感官品质下降。贮藏过程中多种小分子代谢物积累可客观反映牛肉品质劣变程度。因此，基于贮藏期间代谢物变化准确识别潜在生物标志物，对牛肉品质精准监测具有重要意义。传统新鲜度评价主要依赖感官评价和生化、化学指标测定，但主观性较高、灵敏度有限，难以准确识别特定代谢物变化并在分子层面揭示肉质劣变。代谢组学可系统表征和定量生物样品中小分子代谢物，全面理解特定生理状态或贮藏条件下的代谢变化。已有研究表明，在猪肉和禽肉冷藏贮藏中，非靶向代谢组学可有效识别新鲜肉与腐败肉之间的差异代谢物，其中部分差异代谢物与肉品质指标显著相关，可能作为新鲜度评价潜在标志物。基于此，研究人员采用新鲜度指标监测与代谢组学相结合策略，系统表征冷藏牛肉贮藏期间代谢变化，阐明差异代谢物与牛肉新鲜度劣变的内在关联，并针对筛选出的4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸建立基于UPLC–QQQ–MS/MS的靶向定量方法进行绝对定量。该研究旨在识别稳定可靠的新型牛肉新鲜度评价生物标志物，为生鲜牛肉冷链贮藏质量监测和腐败早期预警提供理论依据和技术支持。

研究人员开展的样本来源为中国内蒙古自治区通辽市科尔沁区某屠宰场，同一屠宰批次8头西门塔尔牛（Simmental cattle）后腿肉，每头动物后腿肉分为7份，对应贮藏0、1、3、5、7、9和11 d，共56份样品；每份单独密封于聚乙烯袋中，于4 °C常压贮藏。每个时间点取8份样品作为独立生物学重复（n = 8），用于pH、菌落总数（total viable count，TVC）、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）和硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）测定；0、3、7和11 d样品进一步用于代谢组学分析，分别记为D0、D3、D7和D11。研究结果表明，TVC和TVB-N在第7天超过新鲜度关键限值，pH和TBARS持续恶化，说明4 °C贮藏牛肉在第7天已进入明显可识别腐败阶段，货架期不应超过7 d。非靶向代谢组学筛选出159种差异代谢物，其中26种为三个阶段比较共有差异代谢物，进一步筛选出与TVC、TBARS和TVB-N强相关的14种候选代谢物，并通过受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析最终选定4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸。靶向定量证实，两种标志物在关键腐败点D7及D11显著积累，与TVC和TVB-N超过阈值的时间一致。该研究为冷藏牛肉腐败监测提供了新的潜在分子标志物，并为后续开发快速检测技术提供依据。

关键技术方法概述（约250字）：研究人员以同一批次8头西门塔尔牛后腿肉为样本队列，设置4 °C贮藏0、1、3、5、7、9和11 d，共56份样品；D0、D3、D7和D11用于代谢组学。采用pH、TVC、TVB-N和TBARS监测新鲜度。采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-QTOF-MS）进行非靶向代谢组学分析，MS-DIAL预处理，Massbank和HMDB数据库注释，MetaboAnalyst 6.0进行正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），按变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）>1、P<0.05、倍数变化（fold change，FC）≥1.5或≤0.67筛选差异代谢物，并进行Spearman相关和ROC分析。建立超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（UPLC–QQQ–MS/MS）靶向定量方法，使用标准品、MRM离子对、检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ）进行绝对定量。

3.1 冷藏期间牛肉新鲜度测定：通过监测pH、TVC、TVB-N和TBARS，研究人员发现TVC从初始3.58 log CFU/g升至第7天6.26 log CFU/g，超过鲜肉微生物可接受限值6 log CFU/g；TVB-N第7天升至17.79 mg/100 g，超过国家标准GB 2707-2016规定的鲜肉限值15 mg/100 g；pH从初始5.41逐渐升至第11天5.83；TBARS从0.25 mg/kg升至第11天1.0 mg/kg。结合四项指标变化趋势及阈值，TVC和TVB-N在第7天超过关键限值，pH和TBARS持续恶化，因此在该实验条件下，4 °C贮藏牛肉第7天已进入明显腐败阶段，货架期不应超过7 d，并为后续代谢组学采样点有效性提供依据。

3.2 非靶向代谢组学分析：通过构建D3 vs. D0、D7 vs. D0和D11 vs. D0的OPLS-DA模型，研究人员发现各贮藏时间点样品与D0组沿第一预测成分t[1]完全分离，代谢谱差异显著；D3 vs. D0的R²Y和Q²分别为0.996和0.880，D7 vs. D0分别为0.982和0.901，D11 vs. D0分别为0.996和0.965，1000次置换检验p<0.001，模型拟合和预测性能良好且无明显过拟合。按P<0.05、FC≥1.5或FC≤0.67、VIP>1筛选，D3组20种上调、16种下调，D7组70种上调、26种下调，D11组113种上调、29种下调；Venn图分析发现三个比较组共有26种差异代谢物，共筛选159种差异代谢物。这些差异代谢物主要注释为有机酸及衍生物、脂质及类脂分子、有机杂环化合物、核苷/核苷酸及类似物等，其中有机酸及衍生物占主导。牛肉内源性蛋白酶在屠宰后迅速激活并在冷藏条件下保持活性，促进蛋白质降解为小肽和游离氨基酸，脯氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸等游离氨基酸及部分小肽积累与苦味形成有关；酪氨酸下降常伴随酪胺积累。有机酸及衍生物中丙二酸变化最明显，有机酸过度积累是腐败牛肉酸味增强的重要因素。脂质及类脂分子变化与脂质氧化和膜损伤有关，多数游离脂肪酸在11 d冷藏期间呈增加趋势，并可进一步促进脂质氧化和醛、醇等挥发性化合物生成，加速异味形成。核苷/核苷酸及类似物中，肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）第7天和第11天丰度下降，其降解产物次黄嘌呤和黄嘌呤持续积累，与苦味增加和腐败加重相关。6-羟基烟酸第7天和第11天较新鲜样品D0显著上调；苯环类化合物中的4-羟苯乙醇也在贮藏中后期较新鲜样品显著差异。上述代谢物丰度变化可能与贮藏胁迫下细菌生理代谢密切相关。

3.3 差异代谢物与新鲜度指标相关分析：通过Venn图分析获得26种不同冷藏阶段共有差异代谢物，并进一步采用Spearman相关分析评价其与牛肉新鲜度指标关系。研究人员发现这些代谢物可分为两类相关模式。第一类包括多种酰基肉碱，主要与TVC、TBARS和TVB-N负相关；酰基肉碱是脂肪酸进入线粒体进行β-氧化的重要转运形式，在脂质能量代谢中发挥重要作用。第二类与TVC、TBARS和TVB-N正相关，其中次黄嘌呤、异烟酸、黄嘌呤、对甲酚、6-羟基烟酸、烟酸、4-羟苯乙醇、酪胺以及六种肽（Asp-Trp、Pro-Trp、Ile-Lys、Leu-Pro、Pro-Val和Pro-Ile-Lys）与TVB-N、TVC和TBARS呈强正相关（r > 0.80）。这些代谢物积累与微生物分解活动和肌肉自溶密切相关。次黄嘌呤和黄嘌呤由自溶性核苷酸降解和细菌活动共同形成，是公认的肉新鲜度下降经典指标。烟酸相关化合物包括烟酸、异烟酸和6-羟基烟酸升高，可能与微生物代谢及含烟酰胺辅酶和相关物质降解有关。酪胺是典型生物胺，是肉腐败过程中形成的重要碱性含氮产物和TVB-N主要成分，由微生物酪氨酸脱羧酶催化酪氨酸脱羧生成。对甲酚和4-羟苯乙醇等其他芳香代谢物也源于芳香族氨基酸的微生物降解。六种肽在冷藏第7天和第11天大量检出，可能归因于贮藏后期内源性和微生物蛋白酶共同作用。上述代谢物变化与冷藏牛肉腐败进程密切相关，因此与多种新鲜度指标呈强正相关。

3.4 新型腐败生物标志物筛选：为基于整体代谢谱精准识别可指示牛肉由新鲜向腐败转变的关键标志物，研究人员采用多层筛选策略。首先对26种共有差异代谢物与TVC、TBARS和TVB-N进行Spearman相关分析，按相关系数r > 0.80且与三种指标均显著相关（P<0.05）标准，初步识别14种高度相关代谢物，包括次黄嘌呤、异烟酸、黄嘌呤、对甲酚、6-羟基烟酸、烟酸、4-羟苯乙醇、酪胺和六种肽。14种候选代谢物中，D7和D11时4-羟苯乙醇分别增加28.88倍和115.20倍，酪胺分别增加57.06倍和90.87倍，6-羟基烟酸分别增加33.47倍和66.66倍。进一步对14种候选代谢物进行单变量ROC分析，发现所有候选代谢物AUC均大于0.90，范围为0.922至1.000，表明均具有良好区分能力；其中4-羟苯乙醇AUC最高为1.000，6-羟基烟酸AUC为0.995，二者在14种候选代谢物中区分性能最高。结合相关分析、ROC曲线分析和代谢物积累特征，研究人员最终选择4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸作为牛肉腐败候选生物标志物。冷藏贮藏期间，内源性和微生物蛋白酶可促进肌原纤维蛋白等肌肉蛋白降解，生成蛋白片段、肽和游离氨基酸。酪氨酸在冷藏早期略有增加，可能因蛋白质水解释放游离酪氨酸，其相对丰度随后从D3的1.22倍逐渐降至D11的0.34倍。酪氨酸作为芳香族氨基酸，可能通过两条途径参与4-羟苯乙醇形成：其一，酪氨酸经转氨生成4-羟基苯丙酮酸，随后脱羧为4-羟基苯乙醛，再经醇脱氢酶还原为4-羟苯乙醇；其二，酪氨酸脱羧生成酪胺，进一步氧化脱氨为4-羟基苯乙醛，最终还原生成4-羟苯乙醇。酪胺和4-羟苯乙醇在冷藏期间持续积累，与所提出酪氨酸向4-羟苯乙醇转化途径一致。同时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）等烟酰胺辅酶可能在冷藏期间发生降解或代谢转化，释放烟酰胺；烟酰胺可经烟酰胺酶水解为烟酸，烟酸再经烟酸脱氢酶转化为6-羟基烟酸。非靶向代谢组学显示烟酰胺相对丰度随贮藏时间逐渐降低，而烟酸和6-羟基烟酸持续积累，与所提出烟酰胺经烟酸转化为6-羟基烟酸途径一致。

3.5 4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸的靶向定量：基于非靶向代谢组学分析，研究人员识别出4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸两个候选生物标志物，并提供其MS/MS镜像谱。为验证两种代谢物绝对浓度变化，研究人员建立基于UPLC–QQQ–MS/MS的靶向定量方法。4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸均呈现良好线性，决定系数R²>0.999；4-羟苯乙醇LOD和LOQ分别为66.67和133.33 μg/kg，6-羟基烟酸LOD和LOQ分别为0.67和1.67 μg/kg。靶向定量结果显示，4-羟苯乙醇在D7和D11含量分别达到1025.69和5081.85 μg/kg，6-羟基烟酸分别达到685.18和1368.12 μg/kg，与未靶向代谢组学数据中增加趋势高度一致。在关键腐败点D7，两种代谢物浓度均远超各自LOQ；同一时间点TVC超过6 log CFU/g，TVB-N超过国家标准限值15 mg/100 g，表明两种代谢物急剧积累与牛肉品质劣变关键转折点一致。传统新鲜度评价指标在实际应用中存在局限：TVB-N可靠性受优势腐败微生物组成影响，例如当Shewanella占优势时，挥发性碱性含氮化合物更易在腐败过程中形成，TVB-N与腐败程度对应较好；但当Pseudomonas spp.为优势腐败菌时，TVB-N评价效能相对有限。此外，常规TVC测定耗时耗力，通常需要48–72 h获得结果。传统理化分析在阐明肉腐败潜在分子机制方面有限。本研究中，4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸在“新鲜”向“腐败”转变过程中表现出更明显的阶段特异性积累特征，因此有潜力作为4 °C冷藏牛肉贮藏期间腐败监测的特征性生物标志物。

讨论部分总结：传统新鲜度评价指标存在一定局限，TVB-N受优势腐败菌组成影响，TVC检测耗时，传统理化分析难以在分子层面解释肉腐败机制。本研究中，4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸在牛肉由新鲜向腐败转变时表现出明显阶段特异性积累，且与TVC、TVB-N超过阈值的关键腐败点一致，提示二者有潜力作为4 °C冷藏牛肉腐败监测的候选生物标志物。基于两种代谢物在关键腐败点浓度急剧升高，未来可开发免疫层析试纸条、电化学生物传感器或比色试剂盒等靶向快速检测技术，用于牛肉新鲜度现场实时评价，为肉类供应链质量监测提供便捷高效的新工具。需注意，本研究使用单一品种牛肉，尚需进一步研究验证这些标志物在更广泛样本中的代表性，并精确追溯腐败相关微生物群；未来研究应扩大样本量，纳入多个品种进行靶向绝对定量验证，并整合微生物组学和功能基因分析，完善代谢途径并建立多维腐败预警模型。

研究结论部分翻译：本研究采用非靶向代谢组学筛选与靶向定量验证相结合的策略，筛选并验证4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸作为4 °C冷藏牛肉贮藏期间两种新型腐败生物标志物。非靶向代谢组学结果显示，4-羟苯乙醇在第7天和第11天相对丰度分别达到第0天的28.88倍和115.20倍，6-羟基烟酸分别达到第0天的33.47倍和66.66倍。靶向定量显示，4-羟苯乙醇在第7天和第11天含量分别为1025.69和5081.85 μg/kg，6-羟基烟酸分别为685.18和1368.12 μg/kg。总体而言，4-羟苯乙醇和6-羟基烟酸急剧积累与TVC和TVB-N超过阈值的腐败点一致，表明其作为腐败指示物具有潜力。基于两种代谢物在关键腐败点的浓度急剧升高，未来可开发免疫层析试纸条、电化学生物传感器或比色试剂盒等靶向快速检测技术，用于牛肉新鲜度现场实时评价，从而为肉类供应链质量监测提供便捷高效的新工具。需注意，本研究使用单一品种牛肉，需要进一步研究验证这些标志物在更广泛样本中的代表性，并精确追溯腐败相关微生物群。未来研究应扩大样本量，纳入多个品种进行靶向绝对定量验证，并整合微生物组学和功能基因分析，以完善代谢途径并建立多维腐败预警模型。