竹醋液与罗伦隐球酵母协同增强葡萄柚对绿霉病的抗性机制研究

《Food Chemistry: X》：Enhancing grapefruit resistance to green mold through synergistic effects of bamboo vinegar and Cryptococcus laurentii

　　

论文摘要翻译 竹醋液（Bamboo vinegar, BV）与罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）可抑制葡萄柚中的青霉菌（Penicillium）。1%（v/v）BV与1×107 CFU mL?1的C. laurentii是最佳抑菌浓度。联合处理可上调几丁质酶（CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（GLU）和谷胱甘肽还原酶（GR）的活性，同时降低丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）的含量。联合处理增强了葡萄柚中防御相关酶的活性。联合处理维持了葡萄柚果实的贮藏品质。

论文解读文章

研究背景与目的

葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）作为芸香科柑橘属的多年生常绿果树，其果实富含蛋白质、有机酸及铁、钙等矿物质，并以低糖高维生素C的特性著称，具有显著的营养价值和美容护肤功效。然而，新鲜葡萄柚在采后运输、贮藏和销售过程中极易遭受病原菌侵染，其中由青霉菌（Penicillium）引起的果实腐烂最为严重，导致巨大的采后损失和经济影响。目前采用的物理方法（如低温贮藏、辐照、热处理）成本高昂且操作复杂，而化学杀菌剂则会造成环境污染并对消费者健康构成风险。因此，寻求更安全、环保的采后病害控制方法具有重要意义。利用拮抗酵母作为生物防治手段是一种有前景的无毒替代方案，但拮抗酵母的抑病效果通常弱于化学杀菌剂，亟需开发增强其生防效果的策略。

罗伦隐球酵母（C. laurentii）作为一种具有生防潜力的酵母，近年受到广泛关注。已有研究表明，C. laurentii能够破坏指状青霉（P. italicum）的菌丝结构，激活菜豆中超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化氢酶（CAT）的活性，从而增强植物抗病性并延缓衰老。将保护剂或诱导剂加入培养基可显著提高拮抗酵母的生防效果。竹醋液（Bamboo vinegar, BV）是竹子热解的副产物，富含酚类化合物和有机酸，兼具直接抗菌活性和天然抗氧化特性。不同于壳聚糖和褪黑素等主要通过强化宿主物理屏障或调节内源防御途径发挥作用，竹醋液介导的酵母诱导可实现三重协同效应：直接抑制病原菌、增强酵母活力以及激活果实防御反应。目前，关于竹醋液诱导的C. laurentii对葡萄柚贮藏品质变化影响的研究仍较为匮乏，尤其是其在生理生化层面诱导植物防御机制的潜在机理尚不明确。因此，本研究旨在：1）确定竹醋液和C. laurentii对指状青霉（P. italicum）、意大利青霉（P. digitatum）和扩展青霉（P. expansum）的最佳抑菌浓度；2）评估竹醋液与C. laurentii单独或联合处理对葡萄柚绿霉病的抑制效果；3）探究各处理对葡萄柚防御相关酶活性及防御相关物质积累的影响；4）分析各处理对葡萄柚贮藏品质的变化。

主要技术方法

研究人员采用了体外孢子萌发抑制试验，筛选不同浓度的C. laurentii（10⁵、10⁶、10⁷ CFU mL^?1）和竹醋液（0%、0.1%、0.5%、1%）对三种青霉菌孢子萌发率和芽管长度的抑制作用。通过平板计数法评估不同浓度竹醋液（0%-1%）对C. laurentii生长的影响。采用Calcofluor White（CFW）染色和碘化丙啶（PI）染色评估BV-C. laurentii联合处理对P. digitatum细胞壁完整性和膜通透性的影响。通过测定不同浓度H₂O₂下的活菌数评估酵母的氧化胁迫耐受性。利用试剂盒测定酵母发酵液中过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、几丁质酶（CHI）、β-1,3-葡聚糖酶（GLU）活性及丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量。在葡萄柚果实上进行活体接种试验，评估各处理对三种青霉菌引起的病斑直径和发病率的影响。测定葡萄柚果皮中多酚氧化酶（PPO）、PAL、GLU、CHI活性及总酚、黄酮含量，并评估贮藏28天后果实的总可溶性固形物（TSS）、抗坏血酸（AsA）、可滴定酸（TA）、还原糖（RS）、失重率及色泽参数（L、a、b、c、h⁰）。

研究结果

3.1. 不同浓度C. laurentii对青霉菌的初步抑菌活性筛选

结果表明，1×10⁷ CFU mL^?1的C. laurentii在所有时间点均表现出对P. digitatum孢子萌发的最强抑制作用。对于P. italicum，该浓度在9小时显著降低了孢子萌发率（仅为对照的0.62倍）和芽管长度。对于P. expansum，该浓度同样显著降低了孢子萌发率和芽管长度。

3.2. 不同浓度竹醋液对青霉菌的初步抑菌活性筛选

结果显示，竹醋液浓度越高，抑菌效果越强。1%竹醋液在所有观察时间点均最有效地抑制了三种青霉菌的孢子萌发率和芽管伸长。例如，在19小时，1%竹醋液处理组P. digitatum的孢子萌发率仅为对照组的1/7.10，芽管长度比对照组短37.49%。

3.3. 不同浓度竹醋液对C. laurentii生长的影响

在整个培养期内，不同浓度的竹醋液均未对C. laurentii的生长产生明显抑制作用。培养24小时后，0.2%和1%竹醋液甚至表现出显著的促生长作用。结合抑菌效果，后续实验选择1%竹醋液。

3.4. 竹醋液诱导的C. laurentii对青霉菌孢子萌发率和芽管长度的影响

与单独C. laurentii处理相比，BV-C. laurentii联合处理显著抑制了三种青霉菌的孢子萌发率和芽管长度。例如，在19小时，联合处理组P. digitatum的孢子萌发率仅为14.43%，而C. laurentii组高达75.57%。

3.5. BV-C. laurentii对P. digitatum细胞壁完整性和细胞膜通透性的影响

CFW染色显示，BV-C. laurentii处理组P. digitatum的蓝色荧光强度随时间下降，且在各时间点均显著低于对照组，表明细胞壁完整性受损。PI染色显示，处理组的红色荧光强度在各时间点均显著高于对照组，表明细胞膜通透性增加。

3.6. 竹醋液诱导的C. laurentii对不同浓度H₂O₂氧化胁迫的耐受性

随着H₂O₂浓度升高，两组酵母活菌数均呈下降趋势。但总体而言，BV-C. laurentii处理组活菌数的下降幅度小于非诱导的C. laurentii组，表明竹醋液诱导可增强C. laurentii对氧化胁迫的耐受性。

3.7. 竹醋液诱导的C. laurentii中氧化胁迫相关指标及防御酶活性的测定

与C. laurentii组相比，BV-C. laurentii组的MDA含量和GSH含量显著降低，而GR活性、CHI活性和GLU活性均显著升高。两组间CAT活性无显著差异。

3.8. 竹醋液、C. laurentii及其单独和联合处理对葡萄柚绿霉病的抑制效果

对于P. digitatum，联合处理组从第5天到第20天对病斑扩散的抑制效果显著优于单独处理组。对于P. italicum，所有处理组均显著抑制了病斑扩散，但联合处理组在第20天的病斑直径（4.39 cm）并非最小。对于P. expansum，只有C. laurentii处理组在整个贮藏期内的病斑直径显著小于对照组。

3.9. 竹醋液和C. laurentii单独及联合处理对葡萄柚防御相关化合物及酶活性的影响

联合处理组显著提高了CHI活性（第14天达峰值，为CK的1.30倍）、GLU活性（第14天达峰值，为CK的5.74倍）、总酚和黄酮含量（第7天总酚较CK高19.28%；第28天黄酮为CK的1.20倍）、PAL活性（第21天达71.20 U g^?1）以及PPO活性（第21天达31.65 U g^?1，较CK高28.87%）。

3.10. 竹醋液、C. laurentii及其联合处理对葡萄柚贮藏品质的影响

第28天，联合处理组果实的TSS含量显著高于CK，AsA含量显著高于CK和其他处理组，TA含量显著低于CK，RS含量显著高于CK。在失重率方面，从第7天起，所有处理组的失重率均显著低于CK，其中联合处理组失重率最低。在色泽方面，联合处理组在贮藏末期保持了较高的亮度（L*）和较低的褐变程度。

讨论与结论

本研究表明，1%竹醋液与1×10⁷ CFU mL^?1的C. laurentii联合处理可通过多重机制有效抑制葡萄柚绿霉病并维持果实品质。首先，该联合处理可直接破坏病原菌P. digitatum的细胞壁和细胞膜完整性。其次，竹醋液诱导增强了C. laurentii对氧化胁迫的耐受性，这与其降低MDA和GSH含量、提高GR活性有关，表明酵母的抗氧化防御系统被激活。此外，联合处理显著提升了C. laurentii自身分泌水解酶（CHI和GLU）的能力，这些酶可降解病原真菌的细胞壁。在果实层面，联合处理显著激活了葡萄柚自身的防御系统，包括提高CHI、GLU、PAL和PPO等防御酶活性，并促进总酚和黄酮等次生代谢产物的积累，从而增强了果实的系统性抗性。最终，这种协同作用有效抑制了青霉菌在果实上的生长和扩散，减少了病斑直径和发病率，并在长达28天的贮藏期内更好地维持了葡萄柚的营养品质（如TSS、AsA、RS）和外观品质（如色泽、失重率）。因此，竹醋液诱导的C. laurentii作为一种绿色、高效的采后处理方法，在控制葡萄柚绿霉病方面展现出巨大潜力。