热预处理辅助蒸煮鲣鱼暗肌的双酶水解用于安全可控的生物活性水解物生产

《Food Chemistry》：Thermal pretreatment-assisted dual-enzyme hydrolysis of steamed skipjack tuna dark muscle for safety-controlled bioactive hydrolysate production

　　- 已为蒸制的金枪鱼深色肌肉优化了AL–FL顺序双酶水解条件。- 热处理与较低的相对组胺生成菌相关DNA信号有关。- 热处理预处理限制了组胺和生物胺的进一步积累。- 顺序双酶水解增加了游离和风味活性氨基酸的含量。- 水解产物表现出不同的风味特征并增强了体外生物活性。## 引言鲣鱼（*Katsuwonus pelamis*）是主要金枪鱼品种之一，在全球范围内广泛捕捞和消费，常用于金枪鱼罐头工业。根据国际海产品可持续性基金会（ISSF）的数据，2020–2024年间鲣鱼的年均捕捞量估计约为306万吨（ISSF, 2026）。在金枪鱼罐头行业中，白肌被优先用于商业产品，而深色肌肉由于其颜色深、易氧化以及不受欢迎的风味特征，通常在预煮后修整可食用背肉时被分离出来。因此，大量深色肌肉作为加工副产物产生，常被丢弃或用于生产低价值产品，如鱼粉和动物饲料。蒸制鲣鱼深色肌肉（STDM）约占金枪鱼加工副产物的25%，富含蛋白质和必需矿物质，包括铁、铜和硒。尽管其在食品产品中的直接利用有限，但其高蛋白含量表明其作为低分子量生物活性肽生产底物具有相当大的潜力（Gamarro等, 2013; Qian等, 2007）。然而，深色肌肉因其高组氨酸含量而存在安全隐患，组氨酸可被腐败菌或组胺生成微生物转化为组胺。*莫根氏摩根菌*（*Morganella morganii*）、*肺炎克雷伯菌*（*Klebsiella pneumoniae*）和*芽孢杆菌*（*Bacillus* spp.）已被报道为水产品中与组胺形成相关的微生物（DeBeer & Bell, 2024）。摄入大量组胺可能引发鲭科食物中毒，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧盟委员会制定的监管限值对金枪鱼深色肌肉作为食品原料的使用和出口构成了技术约束（European Commission, 2013; FDA, 2024）。此外，深色肌肉中的血红素铁会促进脂质氧化，导致哈喇异味和其他不受欢迎的风味变化（Sohn & Ohshima, 2010）。因此，需要一种能够控制组胺相关安全风险和质量劣变的加工策略，以实现金枪鱼深色肌肉的高附加值利用。酶解水解有助于将蛋白质转化为低分子量肽和游离氨基酸，这些物质可以贡献血管紧张素转化酶（ACE）抑制和抗氧化活性，并影响风味特征（Cheng等, 2025; Hopkins等, 2025）。这些特性支持了蛋白质水解物作为具有营养和生物活性价值的食品原料的潜在应用。内蛋白酶水解内部肽键并促进蛋白质初始降解，而外肽酶从肽片段中释放末端残基，促进游离氨基酸和低分子量肽的产生。因此，同时使用这两种酶类的顺序双酶水解可以通过其互补的水解作用提高深色肌肉蛋白质的转化效率（Hopkins等, 2025; Kristinsson & Rasco, 2000）。然而，酶解水解通常在适宜所选酶的pH条件下以中等温度进行数小时（Petrova等, 2018）。在水产蛋白水解物生产中，微生物控制仍是独立的考虑因素，可能需要额外的热处理来减少微生物活性（Petrova等, 2018）。在发酵水产品中，组胺产生菌的初始水平会影响后续的组胺积累，突出了控制初始微生物污染的重要性（Satomi, 2016）。热处理作为控制金枪鱼预煮过程中组胺生成菌（HFB）的手段也得到了研究（Nolte等, 2014）。这些发现为在STDM酶解水解前评估热处理预处理、并联合检测微生物指标以及组胺和其他生物胺（BAs）提供了依据。热处理可作为预处理方法，用于减少初始微生物负荷并支持水产品加工和酶解过程中的安全控制（McElvenny等, 2017; Nolte等, 2014）。特别是对于易产生组胺的原料，热处理可减少原料来源的组胺生成微生物，从而有助于限制后续的组胺形成（DeBeer & Bell, 2024; Satomi, 2016）。以往关于鱼蛋白水解物的研究主要集中在水解效率、肽的产生或单个生物活性特性上。然而，对蒸制鲣鱼深色肌肉（STDM）中组胺相关安全性、蛋白质水解效率、风味特征和生物活性特性的综合评估仍然有限。此外，水解产物质量可受氨基酸谱、风味活性化合物和挥发性香气活性化合物的影响，这些变化也可使用电子传感器进行表征。因此，应将安全相关指标和质量相关化学特性与生物活性特性一同评估，以确认STDM衍生物水解物的潜在用途。本研究通过将热处理微生物及组胺相关安全控制与顺序双酶蛋白质转化水解相结合，并在单一加工框架内评估所得的安全性、风味和生物活性特征，来应对这一需求。因此，本研究旨在通过应用热处理辅助的顺序Alcalase（AL）–Flavourzyme（FL）双酶水解，从STDM中生产安全可控的生物活性水解物。首先，基于水解活性和经济可行性建立了合适的顺序双酶水解条件。为此，在热处理后评估了微生物指标、基于细菌DNA的群落谱以及组胺和BAs的变化。酶解水解后，分析了总氨基酸和游离氨基酸谱、基于味觉活性值（TAV）/嗅觉活性值（OAV）的风味和香气特征、电子传感器响应、抗氧化活性和ACE抑制活性，以**评估**STDM水解物的安全性、质量和生物活性特性以及其作为蛋白质类食品原料的潜在应用。### 材料制备本研究中使用的蒸制鲣鱼深色肌肉（STDM）是从东元实业有限公司（韩国 Changwon）的金枪鱼罐头加工过程中获得的副产物。样品在?20 °C下冷冻保存，实验前在4 °C下解冻2小时。解冻后的样品使用实验室均质机（RT-N12, 台湾荣宗精密科技有限公司）切碎1分钟，作为实验材料。用于酶解水解时，### 候选酶的选择（DH的变化）图S1展示了在各酶的最适pH和温度条件下，STDM的DH随酶用量变化的情况。在所有酶处理中，DH随酶用量的增加而增加，表明STDM蛋白质水解受酶用量影响。这可能归因于作用于STDM蛋白质的酶分子数量增加，促进了肽键的断裂。在蛋白酶类酶中，Protease A 2SD、Protease P 6SD、菠萝蛋白酶BR 1200和### 结论本研究发现表明，热处理辅助的顺序双酶水解可作为将STDM转化为安全可控的生物活性水解物的实用策略。在AL:FL = 4:1（w/w）、总酶用量20 mg且顺序添加的最优条件下，5小时后DH达到56.38%。热处理将微生物指标降至检测限以下，并限制了室温暴露过程中的组胺积累，同时较较低的### CRediT作者贡献声明**Changheon Lee**：撰写——初稿、可视化、软件、方法论、形式分析、数据管理、概念构思。**Sumin Kim**：可视化、调查。**Kyeonghwan Hwang**：可视化、数据管理。**Gayeong Jeong**：调查、数据管理。**Seong Hyeon Choi**：调查。**Juhyeon Lee**：调查、数据管理。**Seok-Hee Lee**：形式分析、方法论、撰写——审稿与编辑。**Yong-Jun Cha**：撰写——审稿与编辑、监督、形式分析。**Daeung Yu**：### 未引用参考文献Cobas, Gómez-Limia, Franco and Martínez, 2022### 利益冲突声明作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能已影响本文中报道的工作。### 致谢本研究得到了**食品和药物安全部**的资助（RS-2024-00397633）、**中小企业及创业部**的资助（RS-2025-02310560）、**韩国国家研究基金会（NRF）**通过韩国政府（科学技术信息部）资助的项目（RS-2024-00346944），以及**昌原国立大学**通过2025年讲师-研究生-教师协作研究项目和2026年研究基金的资助。Changheon Lee | Sumin Kim | Kyeonghwan Hwang | Gayeong Jeong | Seong Hyeon Choi | Juhyeon Lee | Seok-Hee Lee | Yong-Jun Cha | Daeung Yu