通过2-溴-N,N-二甲基乙胺衍生化结合液相色谱-高分辨率质谱法对红茶加工过程中的游离脂肪酸进行剖析

《Food Research International》：Free fatty acids profiling during black tea processing by 2-bromo- N,N-dimethylethanamine derivatization combined with liquid chromatography-high resolution mass spectrometry

　　

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  2-溴-N,N-二甲基乙胺首次被用于脂肪酸的衍生化。
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  该衍生化方法简单、灵敏，并且试剂残留物极少。
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  研究了红茶不同加工阶段26种游离脂肪酸的变化情况。
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  C16:0、C18:0、C18:2和C18:3在红茶加工过程中变化最为显著。

引言

红茶是全球消费最广泛的茶叶之一（Wang等人，2026年），其特点是红色的茶汤、丰富的口感和宜人的香气。红茶因其独特的风味和香气而在六大传统茶叶类别中脱颖而出，这种风味和香气与其加工技术密切相关。发酵是决定红茶风味和质量的关键过程。在这一过程中，非挥发性物质会发生剧烈变化，从而赋予红茶独特的风味（Chen等人，2024年）。脂质降解被认为是形成茶叶香气的重要过程之一（Chen等人，2022年）。脂质是茶叶中的关键生物活性化合物，约占茶叶干重的8%。在红茶加工过程中，脂质分解会释放出游离脂肪酸（FFAs），而香气的形成则消耗这些FFAs（Ho等人，2015年；Ravichandran和Parthiban，2000年；Zhang等人，2025年）。此外，脂肪酸在储存过程中的氧化和酸败是导致茶叶质量下降的主要原因（Zhang等人，2023年）。因此，分析红茶加工过程中的FFAs对于更好地理解红茶香气的形成和监测红茶的质量至关重要。

尽管FFAs的分子结构简单，但由于它们的独特性质和在实际样品中的浓度范围广泛，对其进行分析仍然具有挑战性。气相色谱（GC）或液相色谱（LC）结合质谱（MS）已成为分析复杂样品中FFAs的最可靠和最准确的技术（Mantzourani等人，2022年；Nguyen等人，2024年）。然而，MS直接分析FFAs的灵敏度相对较低。在GC–MS中，未衍生化的FFAs的极性羧基会导致峰形拖尾和不可逆的吸附。它们的低挥发性要求高温进样，这会引起热降解并降低响应信号。在LC-MS中，由于亲核能力较低，未衍生化的FFAs在正模式下没有响应。即使在负模式下，饱和FFAs的信号也很弱，因为脱质子化不完全。此外，用于改善峰形的酸性移动相会抑制负离子化。通过酰化、烷基化或硅烷化对FFAs进行化学衍生化是GC–MS和LC-MS分析中的常规且有效步骤。传统上，FFAs在分析前需经过甲基化、三甲基硅烷化等衍生化处理。然而，这些方法需要繁琐的样品预处理，灵敏度中等，且不适用于短链脂肪酸的分析（Leng等人，2013年；Xiang等人，2020年）。

基于化学衍生化的ESI-MS可以显著提高食品和植物中含羧基化合物的检测灵敏度（Zhang等人，2022年）。近年来，由于衍生化辅助LC-MS能更广泛地覆盖各种脂肪酸种类，因此越来越多地用于检测复杂样品中的FFAs。常用的衍生化试剂包括伯胺、肼、溴化物、含氮杂环化合物、季铵盐等。Xiang等人和Zhang等人全面综述了基于化学衍生化的LC-MS方法用于FFAs分析（Xiang等人，2020年；Zhang等人，2022年）。大多数试剂含有带正电荷的基团或易于产生正电荷的基团。检测灵敏度可以提高10到60,000倍，检测限可低至fg到pg。

尽管化学衍生化可以提高检测方法的灵敏度，但其准确性和精度有时仍不足以满足LC-MS定量分析的需求。基质效应是一个重要原因。茶叶是一种化学成分极其复杂的食品，这常常导致严重的离子抑制效应，给使用LC-MS分析茶叶中的微量物质带来挑战（Yu等人，2020年）。使用合适的内部标准是消除基质效应的首选方法，而使用稳定的同位素标记的 analyte 类似物是实现这一目标的最佳选择。然而，获取所有 analyte 的稳定同位素标记类似物是不现实或不经济的。因此，人们开发了同位素编码的衍生化方法（Higashi和Ogawa，2016年）。在这种方法中，使用一对轻质/重质同位素标记的试剂分别标记样品和标准品。然后将标记的样品与质量差异标记的标准品按一定体积比例混合，再进行LC-MS分析。使用重质同位素标记的标准品作为内部标准品来定量样品中的轻质同位素标记的 analyte。这样就可以校正基质效应，并避免使用所有目标FFAs的同位素内部标准品（Feng等人，2022年；Li等人，2024年）。

在基于化学衍生化的LC-MS方法中，总是存在一对矛盾。为了提高电喷雾离子化（ESI）中 analyte 的离子化效率，衍生化试剂应含有易于电离的标签。然而，这些衍生化试剂本身在ESI-MS中会产生强烈的响应，如果使用过量，则会增加仪器污染的风险（Barry等人，2003年；Creasy，1999年；Mochizuki等人，2013年）。当使用2,4-二甲氧基-6-哌嗪-1-基吡啶（DMPP）作为标记试剂时，应通过树脂去除过量的试剂（Leng等人，2013年）。衍生化后的后处理是一种有效的方法，可以在ESI-MS分析前去除过量的衍生化试剂，但这会增加实验的复杂性并延长分析时间。通过六通阀将过量的衍生化试剂转移到废物中可以方便操作。然而，注射针头和LC端口中的残留物无法避免，可能导致后续分析的交叉污染。然而，大多数研究要么没有评估这个问题，要么避开了对衍生化试剂残留问题的讨论。实际上，参与衍生化反应的各种试剂对LC-MS系统的污染是阻碍衍生化策略应用的主要因素之一。因此，开发一种高灵敏度、操作方便、无需后处理且不会污染离子源的衍生化试剂对于使用LC-MS高效分析FFAs具有重要意义。

GC–MS结合柱前衍生化通常用于茶叶中FFAs的定量分析（Chen等人，2024年；Wang等人，2009年；Xu等人，2025年）。与LC-MS在代谢组学和脂质组学研究中的广泛应用相比，通过基于化学衍生化的LC-MS检测茶叶中FFAs的可用分析方法仍然很少且有限（Zhu等人，2022年）。本研究旨在开发一种LC-MS方法用于FFAs的分析。首次选用了一种商业上可获得的化合物2-溴-N,N-二甲基乙胺（BDMEA）作为衍生化试剂。作为2-二甲氨基乙胺（DMED）的类似物，它具有类似的敏化基团（Me?N基团），从而获得相当的产品灵敏度。然而，使用DMED进行衍生化需要添加过量的脱水剂或催化剂（Gowda等人，2022年；Mantzourani和Kokotou，2022年），这增加了质谱仪污染的风险。在本方法中，衍生化系统更为简单，仅添加了两种外部试剂BDMEA和三乙胺，这两种试剂都易挥发。因此，即使不预先去除过量的试剂，BDMEA也不太可能污染ESI-MS源。通过使用一对同位素标记的试剂d₀/d₆-BDMEA，开发的该方法用于红茶中FFAs的定量分析及其在红茶加工过程中的变化追踪。

章节摘录

化学品和试剂

HPLC级甲醇、乙腈（ACN）和异丙醇购自德国达姆施塔特的Merck公司。去离子水使用Millipore公司（美国马萨诸塞州贝德福德）提供的Milli-Q plus超纯水系统制备。甲酸、甲基叔丁基醚（MTBE）和甲酸铵购自中国的J & K Scientific公司。2-溴-N,N-双（甲基-3）乙胺氢溴酸盐（d₆-BDMEA）由中国南通的Wuxi AppTec有限公司提供。

衍生化条件优化

该衍生化策略基于羧酸和烷基卤化物之间的亲核取代反应（图1A）。该反应通常在极性溶剂和碱性条件下进行。为了实现最大转化效率，研究了溶剂、衍生化试剂浓度、碱用量、反应温度和时间等条件，使用了包含所有研究对象的FFAs的混合标准溶液。结果如下

结论

本研究使用了一种新型衍生化试剂2-溴-N,N-二甲基乙胺。据我们所知，这种衍生化试剂尚未用于任何衍生化分析。结合超高效液相色谱-四极杆 Orbitrap 质谱技术，可以在12分钟内实现对44种FFAs（C3-C24）的高覆盖率和高灵敏度分析。该方法操作简单，不需要去除过量的衍生化试剂

CRediT作者贡献声明

Yingying Liu：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法论设计、数据分析。 Xue Wang：软件开发、方法论设计。 Yun Zhang：方法论设计、数据分析。 Danyang Zhang：撰写 – 审稿与编辑。 Lei Zhu：撰写 – 审稿与编辑。 Hongping Chen：撰写 – 审稿与编辑、验证、资源协调、资金获取、概念制定。 Yunfeng Chai：撰写 – 审稿与编辑、验证、资源协调、资金获取、概念制定。

资助

本研究得到了中国农业科学院创新研究团队（CAAS ASTIP-2014-TRICAAS）、中国农业科学院茶叶研究所的关键科研任务（TRI-ZDRW-01-09）以及现代农业产业技术研究体系（CARS-18）的专项资助。

未引用的参考文献

Guo和Li，2010年 Wei和Zeng，2011年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

Yingying Liu | Xue Wang | Yun Zhang | Danyang Zhang | Lei Zhu | Hongping Chen | Yunfeng Chai