《Food Research International》：Deep 4D DIA-PASEF proteomics profiling uncovers processing-dependent differences between Milk fat globule membrane and extracellular vesicles
编辑推荐：
•4D DIA-PASEF 谱分析在复杂的乳制品分级中解析了 3792 种蛋白质。•数据非依赖性 MS2 采集绕过了高丰度蛋白质的遮蔽效应。•实验室乳脂球膜分离保留了完整的细胞内脂质分泌装置。•工业乳清流优先保留可溶性胞外蛋白。•乳清脂肪浓缩物同时富集细胞外囊泡（EV）相关蛋
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4D DIA-PASEF 谱分析在复杂的乳制品分级中解析了 3792 种蛋白质。
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数据非依赖性 MS2 采集绕过了高丰度蛋白质的遮蔽效应。
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实验室乳脂球膜分离保留了完整的细胞内脂质分泌装置。
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工业乳清流优先保留可溶性胞外蛋白。
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乳清脂肪浓缩物同时富集细胞外囊泡（EV）相关蛋白和乳脂球膜（MFGM）相关蛋白。
引言
乳源生物活性成分，特别是乳脂球膜（MFGM）和细胞外囊泡（EVs），被认为是免疫功能、肠道成熟和代谢调节的介质（Manoni 等，2020; Reinhardt 等，2012; Wang 等，2025）。MFGM 是围绕乳脂滴的三元磷脂 - 蛋白层，EVs 是运输功能蛋白质和核酸的纳米级囊泡，两者共享重叠的生物作用。这两种成分在工业乳制品副流中高度富集，包括干酪乳清、酸性乳清和酪乳（Brink 等，2020; Manoni 等，2020; Sprenger 等，2023）。商业乳制品粉，如乳清脂肪浓缩物（WFC），越来越多地用于强化功能性食品和婴儿配方奶粉（Muuronen 等，2021; Sun 等，2024）。然而，工业加工步骤（如高温干燥和机械均质）会对天然胶体和膜结构施加深刻的剪切和热应力，主要是包裹乳脂球的三层膜和双层纳米级细胞外囊泡（Haas 等，2024; Martin 等，2022; Muuronen 等，2021）。这种强加工参数和热工艺可能会损害蛋白质稳定性，导致蛋白质变性、聚集，或从膜和囊泡表面迁移（Colella 等，2024; Kleinjan 等，2021; Midtgaard 等，2025）。同时，实验室分离方法（例如，用于 EVs 的差速超速离心结合体积排阻色谱，或用于 MFGM 的温和搅拌）旨在保留天然蛋白质谱，但受限于低得率和有限的可扩展性（Midtgaard 等，2025）。目前缺乏商业成分和实验室分离物之间蛋白质组谱的系统比较，这限制了我们理解加工如何影响这些生物活性成分的分子组成和功能等效性。
基于液相色谱 - 串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学是表征乳制品基质分子复杂性的基本工具（Gagnaire 等，2009; Lecrenier 等，2021）。迄今为止，数据依赖性采集（DDA）一直是乳制品蛋白质组学中占主导地位的工作流程（Charkow & Rost, 2021; Meier 等，2018）。然而，传统的基于 DDA 的策略存在固有的局限性，特别是随机前体选择和严重依赖 MS1 离子强度来触发碎裂，导致低丰度目标频繁出现缺失值和差的可重复性（Amodei 等，2019; Guo & Aebersold, 2023）。在乳制品基质中，这些缺点被放大，因为高丰度的酪蛋白和乳清蛋白（占总蛋白质的 80% 以上）有效地遮蔽了低丰度的信号目标（Greenwood & Honan, 2019; Sun 等，2023）。虽然高 pH 反相肽分级可以通过减少样品复杂性来部分缓解这一问题（Nissen 等，2013; Wang 等，2011; Yang 等，2012），但它不能完全克服 DDA 采集固有的可重复性问题。为了解决这些挑战，4 维蛋白质组学作为一种强大的进步应运而生，它整合了传统的液相色谱、保留时间和质荷比以及第四个分离维度：通过捕获离子淌度光谱法（TIMS）耦合并行累积串联碎裂（PASEF）实现的离子淌度（Bhat & Infascelli, 2025; Meier 等，2020）。
利用这种多维分离，基于此类 4 维蛋白质组工作流程优化的数据非依赖性采集（DIA）提供了一种强大的替代方案，以克服 DDA 的局限性，特别是复杂基质中的低可重复性和有限的动态范围。通过在扩展的淌度空间中系统碎裂定义隔离窗口内的所有前体，它为整个蛋白质组在庞大的动态范围内提供了可重复的定量记录（Meier 等，2020; Meier 等，2021; Skowronek 等，2023）。虽然最近的 DIA 工作流程已应用于分析不同泌乳阶段、地理区域和各种乳制品副产物中的牛乳脂球膜（Chen 等，2026; Si 等，2025; Su 等，2025），但其在乳源细胞外囊泡中的应用尚不太成熟，主要关注生理泌乳动态或乳腺炎等特定疾病状态（M. Wang 等，2023; Rahman 等，2021）。现有研究还表明，乳细胞外囊泡分析受样品异质性和非细胞外囊泡乳成分的共富集所困扰，使得高纯度和高分辨率的分析工作流程成为重要的下一步（Che 等，2026; Martin Carli 等，2023; Santoro 等，2023）。此外，工业加工环境对这些脆弱的膜组装体施加了显著的物理和热应力，可能诱导主要的蛋白质组改变和分子重新分布（Colella 等，2024; Wiking 等，2022）。因此，需要使用高灵敏度 4 维 DIA 框架进行严格评估，以将商业乳制品与最小加工的实验室标准进行基准比较，从而揭示制造过程如何重塑这些关键的乳膜蛋白质组。
在本研究中，我们构建了高分辨率分级谱库，并采用先进的基于库的 4 维 DIA-PASEF 工作流程，对五种目标乳制品分级的深度蛋白质组进行了比较分析：商业酸性乳清粉（AWP）、酪乳粉（BMP）和 WFC，以及基准实验室分离的 MFGM（MFGM-lab）和细胞外囊泡（EV-lab）。这种比较旨在扩展更宽动态范围内的蛋白质组覆盖度，评估工业加工如何改变天然蛋白质谱和完整性，与温和的实验室分离相比。通过利用 4 维 DIA-PASEF 的灵敏度，本工作建立了制备依赖性蛋白质组变异的详细数据集，提供了关于从含有 MFGM 和 EV 的乳制品成分中提取的蛋白质与实验室制备的蛋白质相比发生变化的新见解。详细的蛋白质组洞察可用于未来对特定乳制品流进行针对性增值利用，将其转化为下一代功能性成分。
章节摘要
材料
Arla Foods Ingredients（丹麦 Viby J）慷慨提供了五种含有 MFGM 和/或 EV 成分的牛乳源分级，作为单一、均质批次以确保样品一致性，包括三种商业配料和两种实验室规模材料。商业配料包括 AWP（一种酪蛋白沉淀的乳清衍生产品，作为低 MFGM 参考）、BMP（一种来自黄油搅拌的奶油衍生副流），和 WFC（一种来自
全局蛋白质组谱分析和一般蛋白质鉴定
为了全面表征五种牛乳源分级（AWP、BMP、WFC、MFGM-lab 和 EV-lab）的蛋白质组景观，采用了一种高灵敏度的基于 DIA-PASEF 的工作流程。基于库（LB）和无库（LF）DIA 搜索策略的初步评估（图 S1）表明，虽然 LF 方法鉴定的蛋白质略多，但它与 LB 工作流程表现出大量重叠。鉴于其更高的严格性和定量一致性（Barkovits 等，2020;
乳膜蛋白质组的工艺依赖性及成分分布
我们的深度蛋白质组谱分析揭示了实验室分离基准和工业乳制品分级之间明显的工艺依赖性分化，证明了制造历史如何塑造最终蛋白质组的功能谱。温和的实验室规模提取有效地保留了一套广泛的天然膜相关蛋白。正如 GO 富集分析所示（图 7b），MFGM-lab 保留了源自细胞内分泌和膜系统的蛋白，
结论
本研究利用高分辨率 4 维 DIA-PASEF 工作流程，建立了商业和实验室来源乳制品分级的深度蛋白质组数据集。我们的发现揭示了不同乳制品流中分子组成和细胞起源的明显加工依赖性分化。温和的无溶剂实验室分离有效地保留了与内质网和脂质滴相关的细胞内生物合成和转运装置。相比之下，工业
CRediT 作者贡献声明
Jing Che: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，可视化，验证，方法论，调查，形式分析。Emil Christian Poulsen: 写作 – 审阅与编辑，验证，方法论，调查，数据整理。Katarzyna Kj?ge: 写作 – 审阅与编辑，软件，方法论，调查，概念化。Camilla Bjerg Kristensen: 项目管理，资金获取，概念化。Nina Aagaard Poulsen: 写作 – 审阅与编辑，监督，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了 Arla Foods Ingredients 和 Arla Foods-奥胡斯大学框架计划通过 EXPLAINED 项目的支持。数据是通过访问奥胡斯大学的研究基础设施生成的，包括 FOODHAY（食物与健康开放创新实验室，丹麦研究基础设施路线图）。
Jing Che|Emil Christian Poulsen|Katarzyna Kj?ge|Camilla Bjerg Kristensen|Nina Aagaard Poulsen|Lotte Bach Larsen|S?ren Drud-Heydary Nielsen
