氢/氘交换质谱揭示抗体介导的 SARS-CoV-2 刺突蛋白变构效应及跨变异株保守脆弱性

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Antibody-mediated allosteric effects and conserved vulnerabilities of SARS-CoV-2 spike protein revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry

SARS-CoV-2 刺突蛋白是中和抗体的主要靶标，但变异株的出现挑战了抗体疗效，并暴露了对其免疫逃逸理解的不足。研究人员利用氢/氘交换质谱（HDX-MS）绘制了与四种靶向不同表位的中和抗体（4A8、Bebtelovimab、S309 和 40590）结合的刺突蛋白（野生型、D614G、Delta 和 Omicron BA.1）的构象动力学。该研究揭示了不同的抗体诱导变构效应，这些效应可传播至结合位点之外。靶向 NTD 的抗体 4A8 稳定了 N3/N5 超级位点，并使 NTD-RBD 连接区刚性化，可能削弱 ACE2 可接近状态。Bebtelovimab 尽管存在变异株突变，仍在 RBD 结合环 1 和 2 维持稳健结合，显示表位扰动极小。S309 靶向保守的非 RBM 表位，使 RBD 铰链区去稳定化，同时稳定 S₂ 亚基，提示抑制受体结合与融合。抗体 40590 保护 HR2 区域并改变 S₂ 相关融合动力学。片段水平 ΔHDX 分析识别出四个反复出现的抗体敏感区域，包括 NTD-RBD 连接区、RBD 铰链区、亚结构域（SD1）区域和融合肽相关区域，在不同变异株和抗体类别中具有保守扰动模式。分子动力学模拟支持这些保守区域与 ACE2 结合界面之间的长程偶联。这些发现揭示了保守动态脆弱性，可能指导广谱冠状病毒治疗设计。

论文解读：

SARS-CoV-2 刺突蛋白（spike protein）通过构象变化介导病毒进入，是中和抗体的主要靶标。但受关注变异株（variants of concern, VOC）持续出现，如 D614G、Delta 和 Omicron BA.1，累积突变扰动刺突蛋白构象动力学和免疫逃逸。刺突蛋白为三聚体，每个原体含亚基1（subunit 1, S₁）和亚基2（subunit 2, S₂）。S₁ 包含 N端结构域（N-terminal domain, NTD）、受体结合域（receptor-binding domain, RBD）及亚结构域 SD1/SD2；S₂ 锚定融合机器，包括融合肽（fusion peptide, FP）和七肽重复区（heptad-repeat, HR1/HR2）。刺突蛋白在闭合（RBD-down）与开放（RBD-up）构象间平衡，血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）结合稳定开放态。D614G 破坏原体间相互作用，促进开放并增强 ACE2 亲和力；Delta RBD 突变 L452R 和 T478K 重塑静电界面；Omicron BA.1 的 RBD 15 个突变降低 RBD 可及性并改变进入途径。中和抗体治疗面临变异逃逸，且不同表位抗体诱导的长程变构网络尚未充分解析。已有结构研究明确抗体结合位置，但抗体结合后构象动力学，尤其靶向 NTD、受体结合基序（receptor binding motif, RBM）、非 RBM 和 S₂ 的不同抗体如何跨变异株扰动，仍不清楚。研究人员因此开展本研究，旨在回答表位特异性如何决定稳定/去稳定、突变如何重塑动态特征、中和抗体是否触发类似 ACE2 的保守变构通路。该论文发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》。

研究人员利用氢/氘交换质谱（hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry, HDX-MS）系统比较野生型、D614G、Delta 和 Omicron BA.1 刺突蛋白与 4A8、Bebtelovimab、S309 和 40590 四种抗体结合后的动态扰动，并结合分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟。结论是抗体诱导的变构效应可传播至结合位点之外，并识别出 NTD-RBD 连接区、RBD 铰链区、SD1 亚结构域和融合肽相关区域四个反复出现的抗体敏感区域，提示保守动态脆弱性，可指导广谱冠状病毒治疗设计。

关键技术方法：刺突蛋白 WT、D614G、Delta、Omicron BA.1 购自 Sino Biological；抗体 4A8 和 S309 来自 Abcam，40590 来自 Sino Biological，Bebtelovimab 在 GenScript 表达纯化。Native PAGE 分析刺突蛋白-抗体复合物。HDX-MS 以 1:1 混合，D₂O 标记 1 和 10 min，在线胃蛋白酶消化与 LC-MS^E，三重复；计算 ΔHDX=bound?unbound，采用 ±0.5 Da 阈值、t 检验 P<0.05 和 FDR 1%。MD 基于 PDB 7KJ2 的 Spike-ACE2 复合物，构建 F312A、D416A、R567A/T573A，使用 Amber 22 模拟 100 ns，三轨迹，CPPTRAJ 分析距离。

结果部分：

3.1 未结合刺突蛋白的变异株特异性动力学：HDX 显示 WT 灵活性最强，尤其 RBD 核心五条 β-折叠；后来变异株 RBD 核心分数氘摄取降低，趋向刚性化。Omicron BA.1 的 NTD 245–264 更灵活，RBD 核心外侧 368–377 动态增加，可能与 S371L、S373P、S375F 相关；ACE2 接触区 442–452 更灵活，而 495–510 更刚性，提示变构补偿。SD1 553–568 在所有变体 1–10 min 氘摄取增加，显示突变诱导去稳定；融合肽 823–832 随进化灵活性增加。

3.2 Bebtelovimab 通过直接表位稳定和变构调节诱导变异株韧性中和：Bebtelovimab 结合 RBD 保守表位 K444、V445、P499。HDX 显示 WT 在 442–449、442–452 和 495–510 保护，与复合物结构一致。变构上，NTD-RBD 连接区 306–318、318–325 保护，RBD 铰链 401–422 去稳定，S₂ 融合肽 823–832 稳定。跨变体 D614G、Delta、Omicron BA.1 在结合环保持保护；D614G 连接区增强稳定，Delta 类似，D614G 和 Omicron BA.1 铰链无增加，Omicron BA.1 在 S₂ 697–736、821–832、928–938 稳定。

3.3 S309 通过保守表位结合和变构融合稳定中和变体：S309 靶向 N343 中心、远离 RBM 的保守表位。HDX 显示 WT RBD 核心 354–378、366–375 保护。变构上 NTD-RBD 连接区 318–325 稳定，RBD 铰链去稳定，S₂ 823–832、903–916 强保护。D614G 335–354 轻微刚性化，Delta 无，Omicron BA.1 319–344 后期稳定；所有变体 SD1 553–568 稳定，S₂ 融合相关保护强，Omicron BA.1 823–833 最高，S₂ 稳定效果比 Bebtelovimab 高 40%。Fc 介导机制可能体内贡献但未直接评估。

3.4 4A8 通过 NTD 表位结合和跨域调节介导中和：4A8 靶向 NTD N3（141–156）和 N5（246–260）。HDX 显示 WT 144–173、154–174、245–264 保护，RBD 无保护。D614G 10 min 仅 130–160 保护；Delta N3 无保护，N5 柔性增加；Omicron BA.1 无显著变化，N3 143–145 缺失导致表位去除。4A8 保护 NTD-RBD 连接区，尤其 10 min，显示 NTD 到 RBD 的渐进刚性化；WT 和 Delta RBD 铰链柔性增加。D614G SD1 和融合肽 1 min 稳定，Delta 和 Omicron BA.1 无显著扰动。

3.5 抗体 40590 通过保护 HR2 和变体依赖变构效应扰动 S₂ 构象动力学：40590 为靶向 S₂ 的嵌合抗体，与 SARS-CoV-2 S₂ 和 SARS-CoV spike 交叉反应，不与 S₁ 和 RBD 交叉反应。HDX 显示 WT HR2 1139–1153、1141–1162 保护，Delta 1138–1157 轻微保护，提示扰动六螺旋束（six-helix bundle, 6HB）形成相关动力学。变构上，NTD-RBD 连接区在 WT 和 D614G 保护，RBD 铰链 401–422 在 WT、D614G、Delta 柔性增加；D614G、Delta、Omicron BA.1 的 SD1 和融合肽保护强于 WT。功能验证尚需开展。

3.6 MD 模拟支持保守 HDX 响应区域的长程构象偶联：选取 NTD-RBD 连接区 F312A、RBD 铰链 D416A、SD1 R567A/T573A。模拟显示 SD1 突变增加 E35-Q493 和 Y41-N501 界面距离波动；F312A 使 Q24-N487 距离范围 4–35 ?，而 WT 最大约 27.5 ?；D416A 变化细微，提示 RBD 铰链是柔性热点而非统一稳定变构节点。

讨论部分：

4.1 与 ACE2 诱导结构重塑比较：ACE2 主要稳定 RBM 并刚性化 S₂，尤其融合肽近端区域（fusion peptide proximal region, FPPR）；抗体变构控制更广泛。NTD-RBD 连接区对 ACE2 反应小，却被所有中和抗体稳定，是独特抗体敏感控制点。RBD 铰链在 ACE2 结合时保护，但抗体结合使其去稳定，提示该区为分子开关。SD1 被 ACE2 和抗体稳定，但模式不同；融合肽被 ACE2 和 Bebtelovimab 稳定，S309 保护更广泛。

4.2 抗体设计治疗意义：四个保守控制段在 WT、D614G、Delta、Omicron BA.1 及 SARS-CoV-1、SARS-CoV-2、BAT-CoV（RaTG13、WIV1）中高度保守。最佳策略可能是稳定 NTD-RBD 连接区并去稳定 RBD 铰链，形成“变构钳”。SD1 是中心节点，S₂ 融合肽和 HR2 高度保守，可作为治疗靶点。

4.3 潜在实验验证：S309 的 S₂ 保护和 RBD 铰链扰动提示受体结合与膜融合转变改变，可用细胞-细胞融合和假病毒中和试验评估；40590 HR2 保护提示 6HB 形成扰动，可用 6HB 组装、融合抑制、冷冻电镜（cryo-EM）和交联质谱验证。刺突构建含稳定取代和 furin 位点修饰，糖基化可能影响 HDX，但主要响应区跨变体和抗体类别重复。

结论翻译：通过系统绘制多个抗体类别和病毒变异株中的这些变构控制点，该研究提供了理解抗体疗效和病毒免疫逃逸分子基础的结构框架。研究人员识别的四个变构片段：NTD-RBD 连接区、RBD 铰链区、SD1 亚结构域和融合肽区域，代表 SARS-CoV-2 甚至 SARS-CoV、BAT-CoV 刺突蛋白中的脆弱性，未来治疗可通过理性设计靶向。这种变构视角补充并扩展传统表位聚焦抗体开发方法，为创建更耐受病毒突变逃逸的 SARS-CoV-2 对策提供见解。

作者贡献包括 Qinyu Jia、Chengxi Liu、Chang Zhao、Zhong-Ping Yao。