《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Tet2 alleviates acute kidney injury by demethylating the
Fgf1 promoter
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急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的特征是肾功能突然恶化、肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TEC）损伤和炎症反应，然而有效的治疗手段有限。在这项研究中，研究人员发现Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2（Tet m
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的特征是肾功能突然恶化、肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TEC）损伤和炎症反应，然而有效的治疗手段有限。在这项研究中，研究人员发现Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2（Tet methylcytosine dioxygenase 2，Tet2）的表达和全基因组5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）水平在AKI患者和小鼠中均显著降低。在TEC中条件性敲除Tet2加剧了肾功能障碍和肾脏炎症。体外实验表明，Tet2敲低加重了细胞损伤和炎症反应，而其过表达则减轻了这些效应。机制上，全基因组重亚硫酸盐测序与RNA测序的综合分析揭示，Tet2通过启动子5hmC修饰增强Fgf1转录，从而减少肾损伤和炎症。此外，高剂量抗坏血酸（一种TET2的药理学激活剂）发挥了显著的肾脏保护作用。总之，对TET2的基因靶向和药理学靶向均恢复了Fgf1启动子处的5hmC水平，并减轻了AKI的严重程度，凸显了Tet2/5hmC/Fgf1轴作为AKI有前景的治疗靶点。
研究背景与科学问题
急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是一种以肾功能急剧下降为特征的临床常见并发症，表现为含氮废物蓄积和尿量减少，常导致住院时间延长、死亡率升高以及进展为慢性肾病和终末期肾病的风险增加。肾小管上皮细胞（tubular epithelial cell，TEC）分布于肾单位各处，负责维持电解质稳态、酸碱平衡和代谢废物排泄。大量证据表明，TEC损伤及其后续的炎症反应是驱动AKI病理生理的核心环节。然而，临床上针对AKI的特异性治疗选择仍然匮乏，干预措施多局限于容量管理和血压维持等支持性疗法。因此，阐明AKI发病中的关键调控因子，对于寻找重要治疗靶点和合理设计有效治疗方案至关重要。
表观遗传调控，尤其是DNA甲基化，在调节基因表达中发挥动态作用。DNA甲基转移酶催化CpG位点胞嘧啶的甲基化，而TET家族双加氧酶则介导主动去甲基化过程。其中，TET甲基胞嘧啶双加氧酶2（TET2）已成为关键调控因子，其功能丧失与癌症、炎症性疾病和心血管并发症等多种疾病相关。尽管在理解其基础生物学方面取得了进展，但TET2在AKI中的精确功能和调控机制仍不清楚。因此，本研究旨在深入探究Tet2在AKI中的作用及其下游分子机制。
研究方法与技术路线
研究人员采用了多种关键技术方法：利用CRISPR/Cas9技术构建了TEC特异性Tet2条件敲除（conditional knockout，cKO）小鼠（C57BL/6背景）；建立了盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）和缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）两种小鼠AKI模型；对人肾活检样本（来自安徽医科大学第二附属医院）进行了免疫荧光分析；结合全基因组重亚硫酸盐测序（whole-genome bisulphite sequencing，WGBS）和RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）进行整合组学分析；采用羟甲基化DNA免疫沉淀（hydroxymethylated DNA immunoprecipitation，hMeDIP）-PCR检测特定区域的5hmC富集情况；通过分子对接分析抗坏血酸与TET2的结合模式。
研究结果
3.1 Tet2表达和5hmC水平在AKI患者和小鼠的TEC中显著降低。 斑点印迹分析显示，接受IRI或CLP手术的AKI小鼠肾脏中5hmC水平明显下降，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）水平升高。Tet2的mRNA和蛋白水平在AKI小鼠中下调，并与肾损伤严重程度相关。免疫荧光证实AKI患者TEC中TET2显著减少。5hmC修饰主要存在于肾小管中，且在IRI小鼠中信号减弱。分段特异性标记物的双重免疫荧光显示TET2主要定位于肾小管各节段，其表达在IRI和CLP小鼠中均显著降低。体外实验中，缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）处理同样降低了mTEC中5hmC水平和Tet2表达。
3.2 TEC特异性缺失Tet2加重CLP和IRI诱导的肾损伤和炎症。 通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TEC特异性Tet2 cKO小鼠。斑点印迹显示，在CLP诱导的AKI小鼠中，Tet2 cKO导致5hmC水平进一步降低，5mC水平相应升高。组织学分析和F4/80免疫荧光表明，Tet2缺失显著加重了CLP诱导的肾小管损伤、炎性细胞浸润和肾功能障碍（血清肌酐和血尿素氮升高）。Western blot、实时PCR和血清ELISA分析显示，Tet2 cKO显著上调了肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）表达，增加了P65核因子-κB（NF-κB）磷酸化水平，并升高了肿瘤坏死因子α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白介素-1β（IL-1β）等炎症细胞因子的表达。在IRI模型中观察到类似的结果。
3.3 TET2抑制LPS和H/R刺激的细胞损伤和炎症。 在LPS刺激下，Tet2敲低进一步降低了5hmC水平，增加了5mC水平，提高了KIM-1和p-P65表达，促进了炎症细胞因子的产生。相反，Tet2过表达显著减轻了LPS诱导的这些反应。在H/R条件下，Tet2敲低加剧了细胞损伤，降低了5hmC丰度同时增加5mC水平，增强了炎症相关基因表达。而Tet2过表达则赋予细胞保护作用，恢复了5hmC水平并减轻了细胞损伤和炎症。
3.4 成纤维细胞生长因子1（Fgf1）被鉴定为Tet2的直接下游靶点。 对H/R处理的mTEC进行WGBS和RNA-seq整合分析。Tet2过表达导致1930个基因的全局DNA甲基化降低，同时328个转录本上调。WGBS确认CpG二核苷酸为主要甲基化位点，在基因外显子区域富集。整合分析筛选出26个重叠候选基因，经进一步验证后，Fgf1、Bcas3和Crebrf表现出最强的转录诱导效应。功能分析显示，沉默这三个基因均加剧H/R诱导的细胞损伤和炎症，其中Fgf1敲低效果最显著。WGBS轨迹显示Tet2过表达后Fgf1启动子区域甲基化显著丢失。hMeDIP-PCR证实Tet2过表达细胞中Fgf1启动子处5hmC富集增强。体内实验表明，Tet2 cKO显著降低了CLP诱导AKI小鼠中Fgf1的蛋白和mRNA水平。在LPS和H/R损伤模型中，Fgf1过表达可减轻Tet2敲低细胞的NF-κB活化和促炎细胞因子表达。
3.5 FGF1通过FGFR介导TET2依赖性肾脏保护作用。 在LPS刺激下，Fgf1敲低显著增强了KIM-1和p-P65表达以及炎症细胞因子产生，而Fgf1过表达则明显抑制了这些炎症反应。在CLP诱导的AKI小鼠中，通过尾静脉注射AAV9-Fgf1过表达载体，Fgf1过表达部分逆转了Tet2 cKO引起的肾损伤和炎症。给予FGFR抑制剂BGJ398后，Fgf1过表达的保护作用基本消失，表现为KIM-1和p-P65表达升高，血清肌酐和血尿素氮水平上升，肾小管损伤加重。
3.6 高剂量抗坏血酸通过激活TET2-FGF1通路减轻CLP和IRI诱导的小鼠AKI。 分子对接分析显示抗坏血酸与TET2催化口袋的多个残基相互作用。在CLP和IRI模型中，高剂量抗坏血酸呈剂量依赖性地增加5hmC水平，降低血清肌酐和血尿素氮水平，升高FGF1蛋白表达，降低KIM-1、磷酸化P65和炎症细胞因子水平。组织学评估证实抗坏血酸治疗减轻了肾小管扩张和糖原积累。当TEC中Tet2被特异性删除时，高剂量抗坏血酸的保护效能基本消失，表明其治疗效果依赖于TET2。主要器官的组织病理学检查未观察到明显的毒性作用。
讨论与结论
DNA甲基化通常与转录抑制和基因沉默相关，而TET酶驱动的主动DNA去甲基化可逆转这些表观遗传标记以上调基因表达。尽管已有大量研究描述了其在胚胎发育、肿瘤发生、神经和心血管疾病中的作用，但主动DNA去甲基化在肾脏病理生理学中的贡献，尤其是在AKI中，仍未得到充分探索。本研究证明，TET2在AKI期间TEC中显著下调，其缺失加重肾损伤和炎症，而恢复TET2则可减轻这些病理改变。机制上，Tet2直接增强Fgf1启动子的5hmC修饰，上调FGF1表达，并通过FGFR信号抑制NF-κB活化。研究进一步确定高剂量抗坏血酸是该通路的潜在药理激活剂。
研究结论：研究人员的发现揭示了AKI中存在功能失调的Tet2/5hmC/Fgf1轴，该轴正常情况下可抑制NF-κB活化和肾脏炎症。值得注意的是，通过高剂量抗坏血酸对该通路进行药理学激活，为AKI提供了一种具有机制支撑的治疗策略。该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。
