《Cell Communication and Signaling》：Junctional plakoglobin regulates intestinal epithelial cell proliferation via MAPK/ERK signaling
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连接斑珠蛋白（Junctional Plakoglobin, JUP）是一种桥粒蛋白（desmosomal protein），对上皮组织完整性和上皮-免疫细胞串扰至关重要。尽管JUP已被证实参与炎症过程，但其在肠道上皮修复中的作用仍不清楚。
在体外实验中，Ca
连接斑珠蛋白（Junctional Plakoglobin, JUP）是一种桥粒蛋白（desmosomal protein），对上皮组织完整性和上皮-免疫细胞串扰至关重要。尽管JUP已被证实参与炎症过程，但其在肠道上皮修复中的作用仍不清楚。
在体外实验中，Caco-2单层细胞和非转化肠道类器官（organoids）中JUP的缺失显著加速了伤口闭合，这一效应由增强的上皮细胞迁移和增殖所驱动。基于类器官的RNA测序通路分析显示，JUP缺失后MAPK/ERK信号通路被激活。Western blot分析中ERK磷酸化水平的升高进一步证实了这一效应。与此一致的是，药理学抑制ERK可消除加速的伤口闭合，证实MAPK/ERK信号通路对该表型至关重要。为进一步验证其在体内的相关性，研究人员使用了一种可诱导的、肠道特异性的JUP基因敲除小鼠模型（iVilCreERT2Jupfl/fl）。在活检诱导的肠道损伤后，JUP缺失显著增强了黏膜修复，伴随细胞增殖和MAPK信号通路的增加，从而证实了体外实验结果。
综上所述，这些发现确立了JUP作为一个此前未被识别的、通过MAPK/ERK信号通路调控上皮细胞动力学和修复的调节因子。
论文解读
一、研究背景与意义
肠道上皮细胞动力学对于维持局部肠道稳态至关重要。上皮细胞运动和增殖的失调会导致旁观者组织损伤，这是炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）等肠道疾病的标志性特征。尽管充分的黏膜愈合已被定义为IBD患者实现临床缓解的关键治疗目标，但调控这一过程的机制仍知之甚少，因此缺乏特异性诱导黏膜愈合的疗法。
肠道上皮的修复需要上皮细胞增殖、迁移、黏附和分化的协调配合，以确保组织持续更新和完整性。越来越多的证据表明，桥粒（desmosomes）在调控这些过程中发挥关键作用，从而通过尚未明确定义的机制促进肠道稳态。在肠道中，桥粒由钙黏蛋白desmoglein2（DSG2）和desmocollin2（DSC2）组成，两者均已被证实参与调控细胞迁移和修复过程中的上皮重塑。连接斑珠蛋白（Junctional Plakoglobin, JUP）是一种与DSG2和DSC2相连的细胞内斑块蛋白，将桥粒钙黏蛋白连接到细胞骨架，从而有助于细胞间黏附和肠道上皮连接复合体的稳定性。此外，JUP已被认定为一种信号枢纽，在角质形成细胞、心脏、肠道及胚胎发育过程中介导关键细胞功能。研究人员此前发现JUP通过p38MAPK依赖性激活炎症小体来调控肠道炎症。鉴于JUP在调控信号通路和平衡细胞间黏附中的关键作用，本研究旨在进一步评估其在肠道上皮完整性和肠道稳态中的作用。
该论文发表于《Cell Communication and Signaling》期刊。
二、主要关键技术方法
研究人员综合运用了多种关键技术方法：使用siRNA介导的JUP敲低Caco-2细胞模型；利用可诱导肠道上皮特异性JUP基因敲除小鼠模型（iVilCreERT2Jupfl/fl）生成小鼠肠道类器官，并通过4-羟基他莫昔芬（4-OH-tamoxifen）诱导JUP缺失，同时采用慢病毒介导的shRNA敲低和过表达策略；建立了人肠道类器官模型（来自德国维尔茨堡大学医院伦理委员会批准的肠切除患者健康切缘组织）；通过划痕伤口愈合实验评估细胞迁移和增殖；利用RNA测序结合KEGG通路富集分析（包括过表达分析ORA和基因集富集分析GSEA）；采用Western blot检测信号通路蛋白磷酸化水平；通过体内结肠镜引导的活检损伤模型评估黏膜伤口愈合；使用dispase-based细胞解离实验评估细胞间黏附强度；以及应用药理学抑制剂（ERK抑制剂FR180204、Ras抑制剂Daraxonrasib、Raf抑制剂Sorafenib、p38-MAPK抑制剂SB203580）和Erk基因共敲低策略验证信号通路特异性。
三、研究结果
1. 斑珠蛋白缺失通过增加增殖和迁移促进Caco-2单层细胞上皮伤口愈合
研究人员在Caco-2细胞中进行siRNA介导的JUP敲低后发现，JUP缺失导致4kDa FITC-dextran旁细胞通透性降低，但在机械应力后细胞间黏附能力下降。TER测量显示JUP缺陷细胞屏障成熟加速。划痕实验表明JUP敲低后24小时和48小时伤口闭合显著加速。Ki-67免疫荧光染色显示JUP缺陷单层细胞中增殖细胞比例显著升高，不仅限于伤口前缘。FAK磷酸化水平显著增强而总FAK不变，表明细胞迁移能力增强。β-catenin（JUP的同源物）的蛋白水平和分布未发生变化。
2. Jup缺陷激活MAPK信号通路并加速肠道类器官伤口闭合
研究人员利用他莫昔芬诱导型敲除和shRNA敲低两种模型证实JUP缺陷加速2D小鼠肠道单层细胞划痕伤口闭合。加入增殖抑制剂丝裂霉素C（mitomycin C）后，Jup缺陷对伤口闭合的效应被消除，表明JUP主要调控细胞增殖而非迁移。RNA测序KEGG通路分析显示化学致癌-受体激活通路（mmu05207）显著富集，包括Ras和PKC介导的信号汇聚至Raf/MEK/ERK1/2通路，即MAPK/ERK信号通路。Western blot证实Jup缺陷类器官中ERK磷酸化显著增加，Ki-67和c-MYC（MAPK驱动增殖活性的下游靶标）表达升高。ERK1/2抑制剂FR180204完全消除了Jup缺陷对伤口闭合、Ki-67、c-MYC和FAK磷酸化的增强效应。Ras抑制剂Daraxonrasib和Raf抑制剂Sorafenib同样阻断了加速的伤口闭合，而p38-MAPK抑制剂SB203580无显著效果。Jup和Erk双重敲低消除了Jup缺陷的增强伤口愈合表型，证实MAPK/ERK通路的特异性。JUP过表达则显著降低伤口愈合率。
3. JUP通过MAPK/ERK信号通路调控人和小鼠类器官上皮再生
Dispase-based细胞解离实验显示Jup缺陷类器官碎片化显著增加，表明细胞间黏附受损，但ERK抑制不能恢复这一表型，说明黏附功能与MAPK/ERK信号通路无关。在人肠道类器官中，shRNA介导的JUP敲低同样显著加速划痕伤口闭合，表明JUP缺失的效应在小鼠和人肠道上皮模型中具有保守性。
4. JUP缺陷诱导MAPK/ERK信号通路激活并促进体内黏膜愈合
在可诱导肠道特异性JUP敲除小鼠模型中，JUP缺陷动物在基础条件下结肠上皮细胞增殖已增加。通过结肠镜引导的活检损伤模型，JUP缺陷小鼠72小时内黏膜愈合达到58.4%±5.1%，显著高于对照组的39.8%±4.7%。伤口区域组织分析显示JUP缺陷动物中ERK磷酸化、c-MYC、Ki-67和pFAK水平显著升高。JUP缺失的效应在修复早期（前48小时）最为显著。
四、讨论与结论总结
本研究揭示了JUP通过调控MAPK/ERK信号通路在调节上皮细胞动力学中的新角色。研究证实JUP缺失通过激活MAPK/ERK信号通路促进上皮增殖从而加速伤口修复，而JUP缺失导致的细胞间黏附受损不受MAPK/ERK信号通路干扰的影响，凸显了JUP作为细胞间黏附重要稳定剂的作用。JUP发挥双重角色：既是维持细胞间黏附的关键分子支架，又是调控上皮增殖所需信号通路的重要调节因子，从而有助于肠道黏膜稳态的维持。
值得注意的是，JUP缺失在体外实验中增加了屏障功能，这与体内未检测到屏障功能改变的现象存在差异，可能归因于体外实验的高敏感性以及体内微生物群、免疫系统、细胞外基质和基质细胞等复杂微环境对表型的补偿或掩盖效应。与DSG2和DSC2缺失导致伤口修复受损不同，JUP缺失产生相反效应，凸显了桥粒各组分在调控上皮修复和屏障功能中的蛋白特异性作用。在非肠道组织（皮肤、前列腺、乳腺）中的研究也支持JUP缺失与增殖和迁移增加相关的观点。本研究是在非癌症背景下首次证实JUP参与调控肠道上皮细胞增殖。
KEGG通路分析表明该效应主要由Ras活性调控驱动。尽管在硅片分析中未发现JUP与MAPK/ERK的直接物理相互作用，但研究人员推测JUP可能作为支架蛋白间接调控MAPK/ERK信号通路，类似于此前发现的JUP-p38MAPK相互作用模式，或通过桥粒邻近组中的erbin蛋白介导间接调控。本研究首次描述了JUP特异性调控Ras-ERK-MAPK信号通路，该通路不仅与肠道炎症相关，还与结直肠癌密切相关。
综上所述，这些发现确立了JUP作为一个此前未被识别的、通过MAPK/ERK信号通路调控上皮细胞动力学和修复的关键调节因子，为理解肠道黏膜愈合机制和开发针对IBD的黏膜愈合治疗策略提供了新的理论依据。
