基于单核RNA测序的马肠道类器官模型的构建与表型表征

《BMC Veterinary Research》：Establishment and multi-resolution transcriptomic landscape profiling of diverse equine intestinal organoid models

摘要

背景

马肠道类器官（EIO）模型能够再现小肠上皮体内的结构和功能，使其成为研究马肠道的理想工具。然而，马肠道上皮细胞的特异性标志基因仍未得到完全阐明。这些问题给实际应用中对 EIO 模型的分化状态和功能完整性进行评估带来了挑战。

结果

本研究成功构建了四种类型的马肠道体外模型，包括常规未分化 3D EIO、分化 3D EIO、浸没 2D EIO 单层和空气 - 液体界面（ALI）单层模型。所有模型均使用从三只健康的 3 岁雄性伊犁马体内分离的空肠隐窝建立。通过单核 RNA 测序（snRNA-seq）对从常规和分化 3D EIO 中获得的 54,495 个高质量细胞核进行了分析。鉴定出五种主要的肠道上皮细胞亚型，包括肠上皮细胞、增殖性隐窝细胞、SOX9⁺ 隐窝细胞、杯状细胞和增殖性转化扩增（TA）样细胞，具有独特的马特异性细胞标志物表达模式。定量分析显示，常规 EIO 由 54.91% 肠上皮细胞、24.72% TA 样细胞、17.54% 增殖性隐窝细胞和 2.82% SOX9⁺ 隐窝细胞组成，在应用的分析标准下未检测到杯状细胞簇。相比之下，分化 EIO 中肠上皮细胞占主导地位，比例超过 91%，杯状细胞占 2.41%，而其他上皮亚型的比例显著降低。进行 RNA 原位杂交以验证原生马空肠组织中亚型特异性标志基因的空间定位。此外，采用批量 RNA 测序比较了浸没 2D EIO 单层与 ALI 模型之间的转录组差异。转录组结果证实，与传统浸没单层相比，ALI 培养系统保留了更高比例的隐窝细胞，并有效促进了马肠道上皮的成熟和终末分化。

结论

本研究通过形态学观察、snRNA-seq 和批量 RNA 测序建立并表征了四种 EIO 模型。未鉴定出稀有的上皮亚群，部分原因是 snRNA-seq 仅检测核 RNA 这一主要局限性以及肠道细胞标志基因种间差异。这些结果推进了我们对马肠道上皮异质性的认识，并为后续的兽医营养学、药理学和肠道疾病研究提供了标准化的体外模型。