含 Pseudomonas fluorescens CCT7997 制剂的施用量依赖性效应对田间大豆生长与土壤微生物属性的影响：探索性功能谱

《Journal of Soil Science and Plant Nutrition》：Optimizing Soybean Growth and Soil Microbial Attributes with Pseudomonas fluorescens: Dose-Dependent Responses and Exploratory Functional Profiles

　　

旨在评估田间种植大豆及土壤微生物属性对含 Pseudomonas fluorescens CCT7997 商业制剂递增施用量的非线性响应。采用四区组随机完全区组试验，比较该制剂的 0、2、4、6 和 8 L ha^?1。评估大豆生长、叶片生理、防御相关酶及常规土壤微生物属性。每处理取一个混合土壤样本进行鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomic sequencing），并进行描述性解读。施用量影响根长（P = 0.002）、地上部长度（P = 0.049）、根鲜重（P = 0.050）和地上部鲜重（P = 0.019）。二次方模型估计根长、地上部长度和根鲜重在 3.01–3.39 L ha^?1 达到最大值。生理指标和粒数未受影响。微生物生物量碳（microbial biomass carbon, MBC）在 6 L ha^?1 最高，而基础呼吸（basal respiration）在 4 L ha^?1 最高。真菌菌丝长度在 4 和 8 L ha^?1 大于其他处理，细菌生物体积在 2 和 4 L ha^?1 大于 8 L ha^?1。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性在所有接种施用量下均低于对照；过氧化氢酶（catalase, CAT）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase, PAL）表现出施用量特异性响应。探索性宏基因组谱在文库间存在变异，在 4 L ha^?1 下 P. fluorescens 占 Pseudomonas 归属序列的 10.66%，而对照为 1.47%。中等施用量，尤其 4 L ha^?1，与最强的早期大豆生长响应和土壤微生物属性的明显变化相关。宏基因组谱揭示复合文库间分类组成和功能潜力的变异，包括 4 L ha^?1 下 P. fluorescens 序列代表性较高。这些发现表明，施用量在田间条件下塑造植物和土壤微生物对 P. fluorescens CCT7997 的响应中具有重要性。

大豆（Glycine max L.）是重要农产品，具有高蛋白和油分含量，并广泛用于食品、动物饲料和工业产品。在巴西等主要产区，在维持大豆生产的同时保护农业土壤生物功能仍是重要挑战。在此背景下，植物生长促生细菌（plant growth-promoting bacteria, PGPB）作为提高作物表现并减少农业生产环境影响的策略组成部分，受到越来越多关注。PGPB 可通过养分溶解与活化、植物激素和铁载体产生、病原生物防治以及调节植物防御反应等使植物获益。其引入农业土壤还可能影响微生物生物量、呼吸活性及土著微生物群落互作，进而可能影响养分循环和植物–土壤功能。然而，微生物接种剂的表现取决于菌株、作物基因型、施用方法、土壤性质、土著微生物区系和环境条件，因此受控条件下观察到的响应并不总能在田间稳定重现。在 PGPB 中，Pseudomonas fluorescens 因该类群菌株的生态和功能多样性而备受关注。这些细菌可定殖根际，产生铁载体及其他与植物生长促进和生物防治相关的活性代谢物。接种 P. fluorescens 也与油料作物包括大豆的根际微生物组变化相关。然而，这些特性具有菌株特异性，其在田间的表达取决于引入菌株的存活与建立及其与宿主植物和土著土壤微生物的互作。响应还可能取决于施用量：低施用量可能不足以产生可检测的植物或土壤属性变化，而超过有利范围后增加施用量可能不提供额外益处。对 P. fluorescens B177 的研究显示，接种密度、施用频率、时间和土壤类型可影响接种剂持久性、植物响应及土著细菌群落变化。由于这些响应依赖菌株、作物和土壤，某一菌株或生产体系的结果不能直接外推到其他条件。土壤微生物生物量和呼吸的变化可能伴随微生物接种剂施用。一项近期荟萃分析报道，微生物接种后土壤微生物生物量总体增加，但响应幅度取决于环境条件、土壤养分状态和接种剂来源。此类变化不应自动解释为土壤功能改善或受损，因为更高的微生物生物量、呼吸或群落组成变化并不必然对应养分有效性增加或植物表现改善。因此，植物和土壤微生物响应应联合评价并根据实验背景解释。尽管 P. fluorescens 的植物生长促进潜力已被广泛研究，但关于田间大豆对某一确定菌株不同土壤施用量的同步形态、生理、酶学和土壤微生物响应的信息有限。检验多个施用量的田间研究尤其重要，因为其可揭示接种处理与非接种对照比较无法检测的非线性响应。此外，重复的常规土壤微生物生物量和活性指标与探索性分类和功能谱之间的关系仍认识不足。研究人员假设，土壤施用 P. fluorescens 后大豆和土壤微生物响应为非线性，中等施用量比最高供试施用量产生更有利响应。本研究评估了含 P. fluorescens 菌株 CCT7997 商业制剂的五种施用量（0、2、4、6 和 8 L ha^?1）对田间大豆形态和生理性状、植物抗氧化和防御相关酶活性以及重复的常规土壤微生物生物量和活性指标的影响。另对每施用量一个复合土壤样本进行鸟枪法宏基因组测序，以探索性描述分类和功能谱。由于该分析未保留生物学重复，宏基因组谱未进行施用量间推断性比较。总体而言，中等施用量尤其 4 L ha^?1 与最强的早期生长响应相关，而 6–8 L ha^?1 未提供额外植物生长益处；土壤微生物属性响应不同，4 L ha^?1 下基础呼吸较高，6 L ha^?1 下微生物生物量碳较高；所测生理指标和粒数无影响，表明响应局限于特定属性和发育阶段。这些发现强调施用量在评价含 P. fluorescens 微生物制剂植物和土壤响应中的重要性，但应受单田块、单生长季、未监测菌株 CCT7997 以及宏基因组无生物学重复等局限约束。

关键技术方法概括：田间试验于 2022/2023 生长季在巴西巴拉那州 Umuarama（23°45′53″ S, 53°17′35″ W，约 430 m）进行，土壤为 Rhodic Ferralsol。采用随机完全区组设计，5 处理、4 区组、20 小区；大豆品种为 Pioneer? 96Y90，2022 年 10 月 15 日手工播种，种子未接种 Bradyrhizobium spp.，播种时施 NPK 10–15–15 280 kg ha^?1。处理为含 Pseudomonas fluorescens CCT7997 的商业制剂 Bio Release（MAPA 登记号 34,123，最低 1×10⁸ CFU mL^?1）土壤施用 0、2、4、6、8 L ha^?1；菌株来源为 Solubio Tecnologias Agrícolas S.A.，保藏于 Tropical Culture Collection（CCT）。R1 期采集植物和土壤，R5 期测定粒数。测定形态、叶片生理、防御相关酶及常规土壤微生物指标；每处理四个小区土壤等量混合，形成一个复合宏基因组样本，共五个文库，进行鸟枪法宏基因组测序并描述性分析。统计采用方差分析、Tukey 检验和二次回归；宏基因组未纳入推断统计。

结果部分：
3.1 大豆生长：在 R1 期，P. fluorescens CCT7997 施用量影响根长（P = 0.002）、地上部长度（P = 0.049）、茎直径（P = 0.044）、根鲜重（P = 0.050）和地上部鲜重（P = 0.019）。根长在 4 L ha^?1 最大，与 6 和 8 L ha^?1 不同，但与对照和 2 L ha^?1 无差异。地上部长度也在 4 L ha^?1 最大，并与 8 L ha^?1 不同；对照及 2、6 L ha^?1 为中间值。尽管方差分析显示施用量影响茎直径，Tukey 检验未检测到处理均值两两差异。根鲜重在 4 L ha^?1 大于 8 L ha^?1，对照及 2、6 L ha^?1 为中间值。地上部鲜重在 4 L ha^?1 大于 6 和 8 L ha^?1，对照和 2 L ha^?1 为中间值。干根重（P = 0.261）和干地上部重（P = 0.111）未检测到施用量效应。

3.2 对 Pseudomonas fluorescens 施用量的生长响应：根长、地上部长度和根鲜重随施用量增加呈二次响应。根长模型为 ? = 30.236 + 2.236x ? 0.371x²，线性（P = 0.0196）和二次（P = 0.0026）分量显著，调整决定系数 R²_adj = 0.5026，最大根长估计于 3.01 L ha^?1。地上部长度模型为 ? = 47.580 + 2.027x ? 0.301x²，二次分量显著（P = 0.0195），线性分量 P = 0.0517，R²_adj = 0.2600，最大地上部长度估计于 3.37 L ha^?1。根鲜重模型为 ? = 13.123 + 1.423x ? 0.210x²，线性（P = 0.0272）和二次（P = 0.089）分量显著，R²_adj = 0.4790，最大根鲜重估计于 3.39 L ha^?1。根鲜重总体处理效应在 5% 概率水平显著（P = 0.050），显著线性和二次分量进一步支持其二次响应。

3.3 生理变量：施用 P. fluorescens CCT7997 未影响电子传递速率（P = 0.139）、光化学淬灭（P = 0.136）、非光化学淬灭（P = 0.364）、氮平衡指数（P = 0.588）、叶绿素指数（P = 0.964）、类黄酮指数（P = 0.529）或花青素指数（P = 0.884）。

3.4 土壤微生物属性：施用量影响微生物生物量碳（MBC；P < 0.001）、代谢商（P = 0.017）和土壤基础呼吸（SBR；P = 0.010）。MBC 在 6 L ha^?1 高于其他处理，其他处理间无差异。代谢商在 6 L ha^?1 低于 4 和 8 L ha^?1，对照和 2 L ha^?1 为中间值。SBR 在 4 L ha^?1 高于对照和 8 L ha^?1，2 和 6 L ha^?1 为中间值。真菌菌丝长度和细菌生物体积在施用量间不同。真菌菌丝长度在 4 和 8 L ha^?1 大于对照及 2 和 6 L ha^?1；对照大于 2 L ha^?1，但与 6 L ha^?1 无差异，2 和 6 L ha^?1 间无差异。细菌生物体积在 2 和 4 L ha^?1 大于 8 L ha^?1；对照和 6 L ha^?1 为中间值且与其他处理无差异。

3.5 探索性宏基因组谱：鸟枪法宏基因组测序为每处理生成一个复合文库，因此分类和功能谱仅作描述性检查，未进行推断统计分析。
3.5.1 真菌组成：Aspergillus 是五个复合宏基因组文库中相对丰度最高的真菌属，在对照文库 T1 中最高，约 21%。Fusarium 是 T1、T2 和 T4 中第二丰富属，也在对照文库中相对代表性最高。两属在接种处理文库中相对较少。Trichoderma 在所有五个文库中均属优势属，在 T4 和 T5 中相对较高。Cordyceps 在 T3 和 T5 中比其他文库代表性更高。Colletotrichum 出现于 T1、T2、T3 和 T5，而 Phytophthora 仅出现于 T4。其他属在五个复合文库间存在描述性变异。由于每处理仅一个复合宏基因组样本，这些模式仅作描述性解释，不视为处理效应证据。
3.5.2 细菌组成：Streptomyces 是五个复合宏基因组文库中相对丰度最高的细菌属，约 7% 至 9%。Bradyrhizobium 和 Nocardioides 也持续为主要属，但相对代表性在文库间变化。归属于 Pseudomonas 的序列在主要属中显示最大描述性变异，其相对丰度在对照 T1 和 4 L ha^?1 处理 T3 较高，尤其在 T3；在 T2、T4 和 T5 中较低。其他常见属包括 Mycobacterium、Sphingomonas、Arthrobacter、Solirubrobacter 和 Microvirga。由于每处理仅一个复合宏基因组样本，这些模式仅作描述性解释，不能证明处理效应。
3.5.3 Pseudomonas fluorescens 在 Pseudomonas 属中的相对代表性：归属于 P. fluorescens 的序列在 Pseudomonas 属内的相对代表性在五个复合宏基因组文库间存在描述性变化。最低值见于对照文库 T1（1.47%），其次为 T2（2.75%）、T5（3.12%）、T4（4.33%）。对应 4 L ha^?1 处理的 T3 文库显示 P. fluorescens 序列相对代表性最高（10.66%）。由于分类在物种水平进行且未使用菌株特异性分子标记，归属于 P. fluorescens 的序列不能特异地归因于所施用 CCT7997 菌株。此外，每处理仅一个复合宏基因组样本，观察到的变异仅作描述性解释，不能证明处理效应。
3.5.4 功能谱：功能注释揭示五个复合宏基因组文库在与碳、磷、氮循环、有机质动态和细胞过程相关序列相对代表性方面存在描述性变异。碳相关类别中，T1 显示碳同化和呼吸相对代表性较高，T2 中分解更突出；T4 以挥发、碳固定和产甲烷代表性较高为特征；T5 中碳固定化、碳矿化和淋溶更突出。磷相关功能中，磷吸收和同化在 T1 更强，磷固定化在 T4，去磷酸化和磷矿化在 T5。氮相关功能中，硝化在 T1 更突出，氨化在 T2，厌氧反硝化在 T3，氮同化在 T4，反硝化在 T5。有机质和细胞过程方面，T3 显示合成和合成代谢、运输和分布、细胞运输、解毒和保护相对代表性较高；T4 显示细胞合成和降解、解吸和再迁移、调节和信号、维持和修复代表性较高；T5 中分解代谢和降解以及循环和分解更突出；T2 中储存和储备以及相互作用和识别代表性较高。由于每处理仅一个复合文库，这些模式提供五个文库中注释功能潜力的探索性描述，不能证明过程速率差异或处理因果效应。

3.6 酶活性：施用量影响过氧化氢酶（CAT；P = 0.015）、苯丙氨酸解氨酶（PAL；P = 0.029）和超氧化物歧化酶（SOD；P = 0.006）活性。CAT 活性在对照中高于 2、4 和 8 L ha^?1；6 L ha^?1 为中间响应，与对照及其他接种处理均无差异。PAL 活性在 2 L ha^?1 高于 8 L ha^?1，对照及 4、6 L ha^?1 为中间值。SOD 活性在对照中高于所有 P. fluorescens 施用量；2、4、6 和 8 L ha^?1 间无差异。施用量未影响几丁质酶（CHI；P = 0.354）活性。

3.7 粒数：粒数未受 P. fluorescens CCT7997 施用量影响（P = 0.989）。该变量检测到区组效应（P = 0.002），表明实验区存在空间变异。

讨论部分总结：施用 P. fluorescens CCT7997 对大豆早期生长产生速率依赖响应。根长、地上部长度和根鲜重在中等施用量下增加，在最高施用量下下降；二次模型估计最大响应在 3.01 至 3.39 L ha^?1，接近 4 L ha^?1。超过该范围增加商业制剂用量未提供额外生长益处。非线性响应可能源于接种密度、菌株建立、资源有效性、土著微生物和植物响应之间的互作。低施用量可能不足以产生可检测效应，而较高施用量不一定增加建立或植物生长。Papin et al. (2024, 2025) 显示 P. fluorescens B177 的持久性及其对植物和土著细菌群落的影响取决于接种密度、施用频率、时间和土壤类型，支持 P. fluorescens 响应不能期望随施用量成比例增加的前提。根长和根鲜重比其他植物属性响应更明显；由于产品施于土壤，根系是植物中最直接暴露于接种剂和根际环境变化的部位。Jiménez et al. (2020) 也报道 P. fluorescens 对包括大豆在内的油料作物生物量积累和根际微生物组成的积极影响。在田间大豆中，Fulaneti et al. (2025) 观察到 Bradyrhizobium japonicum 与 P. fluorescens 共接种后根性状和产量改善；但直接比较受限，因为本研究种子未接种 Bradyrhizobium，且 CCT7997 作为商业制剂中单一细菌菌株施于土壤。所有处理接受相同基础施肥，包括 28 kg N ha^?1，确保养分管理一致；但该氮输入可能影响植物–微生物响应，并限制将发现直接外推到主要依赖共生固氮的大豆生产体系。实验并非设计用于评价 CCT7997 能否替代或减少氮肥或 Bradyrhizobium 接种。虽然总体方差分析显示茎直径存在施用量效应（P = 0.044），Tukey 检验未区分各处理均值，提示经多重比较校正后总体变异不足以产生清晰两两差异。干根或干地上部重未检测到施用量效应，因此 R1 期效应更多体现在植株伸长和鲜生物量而非干物质积累。根鲜重需特别注意，因为总体施用量效应在 5% 概率水平显著（P = 0.050），Tukey 检验显示 4 L ha^?1 根鲜重大于 8 L ha^?1，对照及 2 和 6 L ha^?1 为中间值；同时显著线性与二次分量描述曲线剂量响应，估计最大值在 3.39 L ha^?1，接近观察到的 4 L ha^?1。因此多重比较和回归分析提供互补信息：Tukey 检验识别处理均值间有限两两分离，回归刻画跨施用量的总体定量响应。由于总体效应处于所采用显著性阈值且实验仅在单一田块和生长季进行，该响应应谨慎解释，不应视为确定的农艺最优。地上部长度调整决定系数较低，表明施用量解释的变异比例小于根长和根鲜重；地上部生长可能更受小区环境变异或植株间变异影响。因此地上部长度估计最大值应解释为本实验条件下拟合响应顶点，而非广泛适用农艺推荐。施用量未影响电子传递速率、光化学或非光化学淬灭，也未影响叶绿素、类黄酮、花青素和氮平衡指数。因此，中等施用量下的形态响应未伴随 R1 期所测光化学和光学叶片指标的可检测变化。这不排除所考虑变量或采样时间之外的生理效应，但表明生长响应不能归因于这些指标变化。作物对微生物接种剂的响应在不同环境中差异很大，取决于微生物、作物、施用方法和实验条件（O’Callaghan et al. 2022; Lv et al. 2024）。施用量还影响 CAT、PAL 和 SOD 活性。PAL 活性在 2 L ha^?1 高于 8 L ha^?1，表明该防御相关酶响应未遵循与植物生长相同的速率模式。由于 PAL 参与苯丙烷代谢途径，其活性变化可能反映植物防御或次生代谢调节；但类黄酮指数无施用量效应，表明 PAL 响应未伴随同一采样阶段该光学指标可检测变化。SOD 活性在对照中高于所有 P. fluorescens 施用量。CAT 活性也在对照中高于 2、4 和 8 L ha^?1，而 6 L ha^?1 为中间响应，与对照或其他接种处理均无差异。这些降低可能反映接种后酶诱导降低或抗氧化调节变化，但不应解释为氧化胁迫降低的直接证据，因为未测定活性氧、脂质过氧化及其他氧化损伤指标。此外，几丁质酶活性无施用量效应，表明接种未在所评价防御相关酶中诱导统一响应。土壤微生物属性显示与植物不同的响应。MBC 在 6 L ha^?1 最高，而 SBR 在 4 L ha^?1 最高。Li et al. (2024) 对 335 项研究的荟萃分析发现微生物接种剂对土壤微生物生物量总体正效应，但响应幅度取决于环境胁迫、土壤肥力和接种剂来源。本研究中 MBC 代表总熏蒸提取微生物生物量，不能特异归因于所施用 CCT7997 菌株。6 L ha^?1 较低 qCO₂ 来自 SBR 与 MBC 的关系，与单位微生物生物量呼吸较低一致，但解释需谨慎，因为该商受 6 L ha^?1 MBC 显著增加强烈影响；因此仅较低 qCO₂ 不足以证明微生物效率或土壤健康改善，需功能测量补充。4 L ha^?1 较高基础呼吸表明培养期间土壤微生物群落 CO₂ 释放更多，可能反映微生物活性或底物利用增加，但仅呼吸不能确定响应是否有利于土壤功能。常规微生物测量表明 4 和 6 L ha^?1 响应不同：前者与较高 SBR 和最强植物生长响应相关，后者与较高 MBC 和较低 qCO₂ 相关。这些差异表明植物生长和常规土壤微生物指标未随施用量增加一致响应。真菌菌丝长度和细菌生物体积也对施用量响应不同：真菌菌丝长度在 4 和 8 L ha^?1 较高，细菌生物体积在 2 和 4 L ha^?1 大于 8 L ha^?1。这些对比响应表明真菌和细菌属性未随施用量增加一致变化。由于这些测量代表土壤微生物群落宽泛组分，观察到的变化不能特异归因于 CCT7997 菌株。尽管如此，中等施用量与较高细菌生物体积相关，而真菌菌丝长度在 4 和 8 L ha^?1 均保持相对较高。尽管对早期生长和土壤微生物属性有影响，施用量未影响粒数。早期营养响应不一定持续到生殖发育，因为植物可在作物周期中补偿，生殖性状受接种后环境条件影响。此外，粒数显著区组效应表明实验区空间异质性。由于粒数来自取样植株且未转换为单位面积粒重，不应解释为作物产量。鸟枪法宏基因组谱提供五个复合文库中分类和功能组成的探索性描述。文库间观察到真菌和细菌属代表性差异，包括 Aspergillus、Fusarium、Trichoderma、Streptomyces、Bradyrhizobium 和 Pseudomonas 序列变异。Jiménez et al. (2020) 显示，在保留独立生物学重复和重复采样时，接种另一 P. fluorescens 菌株可改变大豆和其他油料作物根际微生物组。但本研究中每施用量仅一个复合文库，因此观察到的谱不能确立处理对微生物群落组成的影响。对应 4 L ha^?1 的文库显示分类为 P. fluorescens 的序列相对代表性最高。该观察不能确认 CCT7997 菌株建立或持久，因为物种水平宏基因组分类不能区分所施菌株与自然存在的 P. fluorescens 群体；追踪 CCT7997 需要菌株特异性标记、靶向定量分析或回收后分子鉴定。既往研究表明，引入微生物的建立和持久可因土壤和时间而异，强调菌株特异性监测的重要性（Darbon et al. 2024; Papin et al. 2024）。功能谱也在五个复合文库间描述性变异，不同功能类别在不同文库中相对代表性较高。对应 4 L ha^?1 的文库显示与厌氧反硝化、合成和合成代谢、运输和分布、细胞运输、解毒和保护相关序列相对代表性较高。然而，这些模式代表注释功能潜力，不能证明相应过程在土壤中以更高速率发生。宏基因组注释指示从每个样本回收的遗传潜力，而非基因表达或代谢活性。类似地，其他施用量下观察到的谱不能证明接种诱导的微生物功能、胁迫或养分循环变化。总体而言，含 P. fluorescens CCT7997 商业制剂的中等施用量与大豆最强早期生长响应相关，而提高至 6–8 L ha^?1 未提供额外植物生长益处。土壤微生物属性响应不同，4 L ha^?1 下基础呼吸较高，6 L ha^?1 下 MBC 较高。所测生理指标和粒数无影响，表明响应局限于特定属性和发育阶段。这些发现应在单田块和单生长季局限内解释。此外，施用后未在土壤或大豆根中特异监测 CCT7997 菌株，宏基因组测序未保留生物学重复。基础氮肥施用和种子未接种 Bradyrhizobium 也应在将发现外推到其他大豆生产体系时考虑。进一步田间试验应跨不同土壤和生长季，结合小区水平宏基因组测序、菌株特异性监测、根系定殖测量和单位面积产量测定，以评估此处观察响应的稳定性和农艺相关性。

研究结论翻译：在田间条件下，施用 Pseudomonas fluorescens CCT7997 对大豆和土壤微生物属性产生速率依赖性响应。中等施用量，尤其 4 L ha^?1，与最强的早期植物生长响应相关，根长、地上部长度和根鲜重的估计最大值在 3.01 至 3.39 L ha^?1 之间。土壤微生物响应在不同施用量间不同：基础呼吸在 4 L ha^?1 较高，微生物生物量碳在 6 L ha^?1 较高，真菌菌丝长度在 4 和 8 L ha^?1 较高，细菌生物体积在 2 和 4 L ha^?1 较高。所测生理指标和粒数无影响，表明响应局限于特定属性和发育阶段。探索性宏基因组谱揭示复合文库间分类组成和功能潜力变异，包括 4 L ha^?1 下 P. fluorescens 序列代表性较高。总体而言，这些发现表明，在评价含 P. fluorescens 微生物制剂的植物和土壤响应时，施用量具有重要性。