《Journal of Advanced Research》：Integrative genomics decoding DNA methylation-mediated genetic control of complex traits in pigs
DNA甲基化是一种由DNA甲基转移酶催化的保守性表观遗传修饰，可形成5-甲基胞嘧啶。该修饰能够通过有丝分裂维持，并与环境依赖性转录调控相关，使细胞能够响应发育或环境信号调节转录活性。尽管DNA甲基化在人类和模式生物中已被广泛研究，但在家畜中的研究仍相对有限。在猪中，DNA甲基化模式在不同品种、组织和发育阶段存在差异，并与肌肉发育、生长性能和免疫功能等经济重要性状相关联。然而，目前大多数研究依赖于表型组间的差异甲基化分析，这种方法虽能识别表观遗传差异，但提供的机制见解有限，无法区分潜在的遗传驱动因素或阐明遗传支持的调控关系与单纯关联的表观遗传信号之间的区别。尽管Farm Animal Genotype-Tissue Expression项目探索了牲畜基因表达的遗传调控，包括猪在内，但DNA甲基化与三维染色质结构在基因表达和复杂性状变异调控中的相互作用尚未得到全面研究。因此，亟需一个系统的、基于遗传信息的框架来描述DNA甲基化、转录和复杂表型之间的关系。为了应对这些挑战，研究人员从猪骨骼肌中生成了一个多组学调控资源，包括185份全基因组重亚硫酸盐测序样本、148份转录组图谱、8份三维染色质相互作用图谱以及用于遗传分析的全基因组测序数据。利用这些数据，研究人员系统地探索了猪骨骼肌中DNA甲基化的遗传调控及其功能后果。具体而言，研究人员：(i) 利用大规模WGBS数据构建了块分辨率的甲基化数量性状位点图谱；(ii) 整合遗传、表观遗传、转录和三维染色质相互作用信息，优先筛选连接遗传变异与基因表达及复杂性状的调控通路；(iii) 通过开发基于甲基化的遗传评分，将遗传锚定的甲基化信号转化为经济重要性状的预测模型；(iv) 利用靶向表观基因组编辑，为优先筛选的SOCS3相关甲基化调控关系提供基因座水平的功能支持。为方便社区访问，研究人员进一步建立了一个交互式在线资源，可查询和可视化本研究中生成的整合调控图谱。综上所述，这些分析支持DNA甲基化作为一种受遗传调控且可解释的调控层，并为牲畜的功能注释和候选基因座优先筛选提供了资源。
研究解读：整合基因组学解码DNA甲基化介导的猪复杂性状遗传调控
一、研究背景与科学问题
DNA甲基化作为一类保守的表观遗传修饰，通过DNA甲基转移酶催化胞嘧啶残基的共价甲基化形成5-甲基胞嘧啶。该修饰可通过有丝分裂稳定维持，并与环境依赖性的转录调控密切相关，使细胞能够在发育或环境信号刺激下动态调整转录活性。尽管DNA甲基化在人类和模式生物中已有大量研究，但在家畜领域的研究仍相对滞后。在猪中，DNA甲基化模式在不同品种、组织及发育阶段表现出显著差异，并与肌肉发育、生长性能和免疫功能等重要经济性状相关。然而，现有研究大多依赖表型组间的差异甲基化分析，这类方法虽然可以识别表观遗传差异，但难以区分其中的遗传驱动因素，也无法厘清遗传支持的调控关系与单纯关联的表观遗传信号之间的本质区别。此外，尽管Farm Animal Genotype-Tissue Expression项目已对包括猪在内的牲畜基因表达遗传调控进行了初步探索，但DNA甲基化与三维染色质结构在基因表达及复杂性状变异调控中的协同作用仍未得到系统研究。因此，亟需建立一个基于遗传信息的系统性框架，以表征DNA甲基化、转录和复杂表型之间的内在联系。
二、研究方法与技术路线
为攻克上述难题，研究人员构建了一套涵盖猪骨骼肌的多组学调控资源，包括185份全基因组重亚硫酸盐测序样本（其中56份为新产生，129份来自公共数据集）、148份转录组测序图谱、8份三维染色质相互作用图谱以及全基因组测序数据。关键技术方法包括：利用Bismark进行重亚硫酸盐测序数据的比对和甲基化提取，使用tensorQTL进行顺式甲基化数量性状位点的定位，通过wgbstools识别CpG区块，采用coloc和HyPrColoc开展共定位分析，借助Summary-based Mendelian Randomization评估因果调控关系，利用弹性网络回归构建甲基化预测模型并开发基于甲基化的遗传评分，最后运用CRISPR-dCas9-TET1靶向表观基因组编辑技术进行基因座水平的功能验证。
三、研究结果
Genotype effects on DNA methylation in pig skeletal muscle
通过对185份WGBS样本的分析，研究人员获得了约500亿条高质量读段，平均比对率为87.55%。经Beagle填补后，在严格的DR2 > 0.9阈值下保留了高置信度变异，平均精确度为89.75%，基因型一致率为93.49%。最终获得12,198,858个高质量变异位点。WGBS数据共鉴定出5,252,594个CpG位点和1,245,159个CpG区块。主成分分析显示甲基化谱和基因表达谱均呈现明显的品种相关结构，协变量校正后该聚类模式显著减弱。
Allele-specific methylation analysis
研究人员利用CGmapTools对每个个体进行等位基因特异性甲基化鉴定，通过Fisher精确检验评估等位基因间的甲基化差异，并经Benjamini-Hochberg程序进行多重检验校正。最终要求在至少5个个体中信息可用、至少在2个个体和20%的信息个体中检测到ASM，且至少80%的ASM阳性个体表现出一致的等位基因方向，从而鉴定出高置信度的复发性ASM信号。
Methylation quantitative trait loci mapping
在CpG位点水平和CpG区块水平分别进行了meQTL定位。通过tensorQTL在1 Mb窗口内鉴定显著的SNP-甲基化特征对，采用FDR校正。利用前向后逐步回归识别多个独立的顺式QTL信号。交叉队列一致性分析显示，在新产生队列和公共队列间meQTL关联具有良好的可重复性。
Expression quantitative trait methylation mapping
研究人员将每个基因与其转录起始位点上下游1 Mb范围内的CpG位点和区块进行配对，利用MatrixeQTL检测DNA甲基化水平与基因表达水平的关联。纳入基因型和甲基化主成分以及10个PEER因子作为协变量，以FDR < 0.05为显著性阈值。
Cis-heritability estimation of DNA methylation site
利用GCTA估计每个CpG位点和CpG区块的顺式遗传力，采用线性混合模型，以1 Mb窗口内的SNP构建遗传关系矩阵。
Functional enrichment analysis of meQTLs
通过Variant Effect Predictor和15种肌肉组织染色质状态注释对meQTL进行功能注释，利用TORUS评估富集程度。同时使用FIMO和HOMER2预测meQTL区域的转录因子结合位点，并通过atSNP分析等位基因特异性基序亲和力变化。
Sequence-based prediction of chromatin accessibility at meQTLs
利用已发表的序列预测模型评估meQTL对单细胞染色质可及性的潜在影响，通过比较两个等位基因的预测得分量化等位基因效应。
Colocalization analysis of meQTLs with GWAS and eQTLs data
利用coloc包对meQTL结果与GWAS汇总数据和PigGTEx eQTL数据进行共定位分析，以PPH4 > 0.8为强共定位证据。
HyPrColoc colocalization analysis
采用HyPrColoc进行甲基化-表达、甲基化-表型以及甲基化-表达-表型的联合共定位分析，以PPFC > 0.80为共定位标准。
SMR analysis of meQTLs with GWAS and eQTLs data
通过Summary-based Mendelian Randomization分析meQTL与GWAS和PigGTEx eQTL数据的关联，以PSMR < 10-4和PHEIDI > 0.05为显著关联阈值。
Moloc and OPERA analysis
整合meQTL、eQTL和meta GWAS数据，利用moloc进行多性状共定位分析，并以OPERA框架进一步评估GWAS位点与eQTL和meQTL信号的共定位情况。
Mediation analysis using two-step and multivariable Mendelian randomization
通过两步孟德尔随机化和多变量孟德尔随机化评估DNA甲基化在遗传变异对基因表达和下游复杂性状影响中的中介效应，计算间接效应和中介比例。
DNA methylation level prediction model training
基于区块水平甲基化数据，利用弹性网络回归构建甲基化预测模型，并通过S-PrediXcan进行表观基因组关联分析。
Construction and evaluation of methylation-based genetic scores
通过十轮五折交叉验证构建基于甲基化的遗传评分，评估其表型预测性能。结果显示MGS能够捕获有意义的表型变异，且与多基因评分的联合模型表现出更好的预测能力。
Variance component analysis
利用GCTA的REML方法估计DNA甲基化和全基因组SNP所解释的表型方差，发现DNA甲基化在SNP效应之外仍能解释部分表型变异。
Cell culture and treatment
为功能验证优先筛选的SOCS3相关CpG区块，研究人员在水生化猪骨骼肌卫星细胞中进行靶向去甲基化处理，评估SOCS3蛋白丰度和增殖相关细胞表型。
sgRNA design and vector construction
针对优先CpG区块设计sgRNA，优先选择靠近候选甲基化区域且脱靶效应最小的引导序列，克隆至GV391-dCas9-TET1载体。
Lentiviral infection and downstream functional assays
以MOI为50感染水生化猪肌肉卫星细胞，通过Western blot检测SOCS3蛋白丰度，CCK-8法连续监测增殖能力，流式细胞术分析细胞周期分布。
Western blot
采用标准Western blot流程检测SOCS3蛋白水平，使用兔多克隆抗SOCS3抗体进行免疫印迹。
Cell proliferation and cell cycle assay
通过CCK-8法和流式细胞术分别评估细胞活力和细胞周期分布。
Bisulfite amplicon sequencing
对目标甲基化区域进行重亚硫酸盐扩增子测序，验证CRISPR-dCas9-TET1编辑后的甲基化改变。
Web construction
建立了PSMEA数据库，采用Vue 3前端和FastAPI后端，通过Nginx部署，支持高效的交互式数据检索和可视化。
四、讨论与结论
本研究通过大规模多组学整合分析，系统揭示了猪骨骼肌中DNA甲基化的遗传调控机制及其在复杂性状中的作用。研究表明，遗传变异在CpG位点和CpG区块两个层面广泛塑造DNA甲基化模式，这些受遗传调控的甲基化信号与基因表达和生产性状变异显著关联。通过共定位分析、孟德尔随机化和Hi-C数据整合，研究人员优先筛选出甲基化连锁的调控关系，并利用CRISPR-dCas9-TET1靶向表观基因组编辑为SOCS3相关甲基化区块提供了基因座水平的功能支持。研究结论指出，DNA甲基化是一个受遗传调控且可解释的调控层，本研究为牲畜的功能注释和候选基因座优先筛选提供了重要资源和理论基础。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。
