《Journal of Cleaner Production》：Valorization of spent coffee grounds into metal–phenolic coatings for producing spray-dried microbial biostimulants for sustainable agriculture
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生物刺激素作为传统化学投入品的可持续替代品，在农业行业中正迅速获得关注，用以改善作物健康与产量。其中微生物接种剂（microbial inoculants）为作物提供有益植物微生物，增强养分吸收与抗逆性，从而在改善生长的同时减轻环境影响。微生物接种剂可呈液态或
生物刺激素作为传统化学投入品的可持续替代品，在农业行业中正迅速获得关注，用以改善作物健康与产量。其中微生物接种剂（microbial inoculants）为作物提供有益植物微生物，增强养分吸收与抗逆性，从而在改善生长的同时减轻环境影响。微生物接种剂可呈液态或干态形式。干态接种剂可降低储存与运输成本、延长货架期并减少产品污染，可通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、流化床干燥或空气干燥等方式生产。尽管喷雾干燥因其可扩展性和成本效益而被广泛使用，但其使细胞暴露于高温环境，导致蛋白质和膜损伤，从而造成存活率损失。快速脱水和干燥储存也使细胞承受显著的渗透胁迫。大多数固氮、有益植物细菌为革兰氏阴性且不产孢，使其对脱水胁迫尤为敏感，严重限制了干态微生物接种剂的存活率及随之而来的有效性。因此，有必要开发保护性策略以提高细菌在喷雾干燥过程中的存活率，从而生产出具有足够高活细胞载量以保证接种剂有效性的微生物接种剂。
研究人员已采用多种策略来保护革兰氏阴性、有益植物细菌在喷雾干燥过程中的存活。它们曾与蔗糖、脱脂乳或淀粉等保护剂一同喷雾干燥，但即使添加辅料，许多革兰氏阴性细菌在干燥过程中仍经历多个数量级的损失。交联海藻酸盐微胶囊（CLAMs）也曾用于保护革兰氏阴性抗真菌细菌Collimonas arenae Cal35，该菌在淀粉或麦芽糊精中喷雾干燥时存活率低于检测限，但当淀粉与CLAMs联用时仍经历3个数量级的损失。类似地，CLAMs与海藻糖和麦芽糊精辅料联用保护Klebsiella variicola，尽管细菌仍经历高达4个数量级的损失。Klebsiella michiganensis在无进化适应的情况下，在CLAMs系统中经历约5个数量级的损失。海藻酸盐的添加也有效改善了Enterobacter sp. 14在麦芽糊精中喷雾干燥的存活率，以及Pseudomonas fluorescens在聚衣康酸中的存活率。对喷雾干燥敏感的物种即使采用上述配方，在干燥过程中仍经历多个数量级的损失，因此有必要开发额外的保护策略。
保护革兰氏阴性细菌的一个潜在途径是在其细胞表面形成金属-酚醛网络（MPNs）。MPNs是由酚类化合物（天然具有粘附性，非常适合涂层）与金属阳离子配位形成的表面涂层，金属阳离子的正电荷介导网络的形成。MPNs已在许多领域得到应用，包括用于传感、成像、药物递送和催化的薄膜形成。MPNs也已用于原核和真核细胞的单细胞封装，包括保护酵母免受紫外线辐射、裂解酶和银纳米颗粒的侵害。MPNs还用于保护益生菌在冷冻干燥过程中的存活。与保护有益植物细菌特别相关的是，MPNs已被用于保护革兰氏阴性、固氮细菌Pseudomonas chlororaphis在冷冻干燥及后续储存过程中的存活。然而，该技术尚未应用于高温、快速干燥方法；因此，MPNs能否有效保护有益植物细菌在喷雾干燥过程中的存活仍是一个悬而未决的问题。
金属-酚醛网络可由多种金属阳离子和酚类形成，其中许多存在于农业残余物中，如葡萄渣、浆果籽和芒果皮。一类富含酚类的农业工业残余物是废弃咖啡渣（SCGs）。SCGs是咖啡冲泡过程的主要副产品，其处置成本高昂且需占用大量土地。SCG的降解还会因释放有毒化合物和温室气体而污染环境。根据国际咖啡组织（ICO）的数据，2022至2023年间约产生了692万吨干废弃咖啡渣。这一废物流的规模及其经济和环境影响 necessitates 其利用途径的开发，人们对循环咖啡经济的发展兴趣日益增长。废弃咖啡渣富含酚类化合物，如绿原酸和咖啡酸，尤其是来自冷萃咖啡的SCGs，因其加工温度较低而保留更多酚类物质，使其成为MPN形成的理想候选材料。事实上，咖啡酸MPNs此前已被用于形成薄膜和微胶囊。然而，SCG在MPN形成中的效用仍 largely 未被探索，SCG提取物尚未被应用于形成MPNs并在喷雾干燥过程中保护细菌。
研究人员假设基于SCG的MPNs能够保护微生物接种剂中的多种有益植物革兰氏阴性物种。农业中常用的固氮细菌包括Azospirillum、Enterobacter、Pseudomonas和Klebsiella属的微生物，这些均为革兰氏阴性菌，因此特别需要保护以承受热干燥，从而在干态接种剂中发挥其有益植物特性。Klebsiella属中的物种，包括K. pneumoniae、K. variicola、K. oxytoca、K. quasivariicola和K. aerogenes，通过养分增溶、植物激素产生、固氮、铁载体产生和乙烯水平的酶促还原对植物有益。K. michiganensis M5al（先前归类为K. oxytoca M5al）是此类具有有益植物特性的Klebsiella之一，被认为是用于研究生物固氮的模式革兰氏阴性细菌。
本研究中对K. michiganensis M5al进行了封装，以研究MPNs对细菌在喷雾干燥过程中存活的影响。本研究聚焦于与高温干燥相关的胁迫保护，因为成功的喷雾干燥是规模化生产货架稳定且有效接种剂的第一个关键屏障。研究目标是确定用单宁酸或SCG提取物形成的MPNs能否保护细胞免受喷雾干燥诱导的脱水胁迫，从而提高干燥细胞的存活率。首先使用单宁酸-铁(III) MPNs证明MPNs在喷雾干燥过程中保护革兰氏阴性细菌的有效性，然后使用从冷萃SCG中提取的酚类化合物重复该过程。通过展示其保护能力，为使用MPNs和富含酚类的农业工业残余物形成MPNs以保护革兰氏阴性细菌免受干燥和热胁迫（如喷雾干燥过程中遇到的胁迫）建立了概念验证。
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一、研究背景与问题
生物刺激素作为传统化学农业投入品的可持续替代方案，在农业领域受到日益广泛的关注。其中微生物接种剂通过向作物提供有益微生物，增强养分吸收和抗逆性，从而改善作物生长并减轻环境影响。微生物接种剂可分为液态和干态两种形式，干态接种剂在储存成本、运输成本、货架期和抗污染能力方面具有显著优势，可通过冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、流化床干燥或空气干燥等方式生产。
喷雾干燥因其可规模化且成本效益高而被广泛采用，但其过程使细菌细胞暴露于高温环境，导致蛋白质和细胞膜损伤，造成大量细胞死亡。快速脱水和干燥储存还会使细胞承受显著的渗透胁迫。大多数固氮、有益植物细菌属于革兰氏阴性且不产孢的微生物，对脱水胁迫尤为敏感，这严重限制了干态微生物接种剂的活菌载量及其田间应用效果。
已有多种保护策略被尝试用于喷雾干燥过程中的细菌保护，包括使用蔗糖、脱脂乳、淀粉等保护剂，但即便添加辅料，许多革兰氏阴性菌仍经历多个数量级的存活损失。交联海藻酸盐微胶囊（CLAMs）虽能提供一定保护，但Klebsiella variicola仍损失高达4个数量级，Klebsiella michiganensis在无进化适应的情况下损失约5个数量级。因此，亟需开发新的保护策略以提高革兰氏阴性有益菌在喷雾干燥过程中的存活率。
金属-酚醛网络（MPNs）是一种由酚类化合物与金属阳离子配位形成的表面涂层，酚类化合物天然具有粘附性，金属阳离子的正电荷介导网络形成。MPNs已在传感、成像、药物递送、催化等领域得到广泛应用，也被用于原核和真核细胞的单细胞封装，以及益生菌冷冻干燥保护。此前研究已证明MPNs可在冷冻干燥及储存过程中保护革兰氏阴性固氮菌Pseudomonas chlororaphis，但该技术尚未应用于高温快速干燥方法。因此，MPNs能否在喷雾干燥过程中有效保护有益植物细菌仍是未解问题。
废弃咖啡渣（SCGs）是咖啡冲泡过程的主要副产品，其处置成本高昂且占用大量土地，降解过程还会释放有毒化合物和温室气体。根据国际咖啡组织（ICO）数据，2022至2023年间全球约产生692万吨干废弃咖啡渣。SCGs富含绿原酸和咖啡酸等酚类化合物，尤其是冷萃咖啡产生的SCGs因加工温度较低而保留更多酚类物质，是MPN形成的理想候选材料。然而，SCG提取物此前尚未被应用于MPN形成及喷雾干燥细菌保护。
二、研究目标与关键方法
本研究以Klebsiella michiganensis M5al为模式菌株，该菌株具有固氮等有益植物特性，被广泛用于生物固氮研究。研究人员旨在验证两个核心假设：一是MPNs能否在喷雾干燥过程中保护革兰氏阴性细菌；二是从废弃咖啡渣中提取的酚类化合物能否替代昂贵的单宁酸形成功能性MPN涂层。
研究采用的主要技术方法包括：Folin-Ciocalteu比色法测定SCG提取物的总酚含量（以没食子酸当量GAE表示）；金属-酚醛网络涂层技术，通过将细胞重悬于酚类溶液并添加FeCl?形成MPN涂层，设置了多种涂层方案——FeTA2（单宁酸两次涂层加洗涤）、FeTA1（单宁酸一次涂层无洗涤）、FeSCG（SCG提取物加FeCl?，三个浓度梯度0.2、0.7、1.8 mg/mL GAE）以及SCG（仅SCG提取物不加FeCl?，三个浓度梯度）；Buchi B-290喷雾干燥器进行喷雾干燥（入口温度150°C，目标出口温度60-65°C）；平板计数法测定喷雾干燥前后细菌存活率。所有处理组均以10%（w/w）麦芽糊精溶液作为喷雾干燥基质，以确保存活率差异归因于MPN涂层而非干燥基质。SCG来源为哥伦比亚Planadas-Tolima地区有机种植的咖啡豆经冷萃冲泡后的残渣。
三、研究结果
单宁酸-Fe(III) MPN涂层对喷雾干燥存活率的影响
研究人员首先以单宁酸-Fe(III) MPN验证概念。FeTA2处理（两次涂层加洗涤）和FeTA1处理（一次涂层无洗涤）均显著提高了K. michiganensis M5al在喷雾干燥后的存活率，与未涂层对照组相比，存活率提升约2个数量级。FeTA1与FeTA2之间无显著差异，表明一次涂层且无需洗涤的一锅法即可达到与复杂两步涂层相当的保护效果，这为工艺简化提供了依据。
SCG提取物-Fe(III) MPN涂层的保护效果
研究人员用SCG提取物替代单宁酸进行一锅法涂层。FeSCG_0.7和FeSCG_1.8处理（SCG提取物浓度分别为0.7和1.8 mg/mL GAE）显著提高了喷雾干燥后细菌存活率，与未涂层对照相比提升约2个数量级，保护效果与单宁酸基MPN相当。FeSCG_0.2处理（0.2 mg/mL GAE）虽有一定保护趋势但未达显著水平，表明SCG提取物浓度对保护效果具有关键影响。
SCG提取物单独涂层的效果
仅用SCG提取物（不加FeCl?）的SCG处理组在所有浓度下均未显著提高细菌存活率，与未涂层对照无显著差异。这一结果表明，酚类化合物与金属阳离子配位形成MPN网络是保护作用的关键机制，单独的酚类吸附不足以提供有效保护。
喷雾干燥粉末物理性质
各处理组的喷雾干燥粉末回收率和含水量无显著差异，表明MPN涂层不影响喷雾干燥的工艺性能，且保护效果差异可归因于涂层本身而非粉末物理性质的差异。
四、讨论与结论
本研究首次证明金属-酚醛网络涂层可有效保护革兰氏阴性有益植物细菌在喷雾干燥过程中的存活，将MPN保护技术从冷冻干燥拓展至高温快速干燥领域。研究同时证实了废弃咖啡渣可作为酚类化合物的可持续来源，其提取物形成的MPN涂层在保护效果上与昂贵的单宁酸基MPN相当，为咖啡产业废弃物的循环利用提供了新的高值化路径。
研究结论指出：单宁酸-Fe(III) MPN和SCG提取物-Fe(III) MPN均能显著提高K. michiganensis M5al在喷雾干燥过程中的存活率，且保护效果依赖于金属阳离子与酚类化合物配位形成完整MPN网络。SCG提取物浓度需达到一定阈值（≥0.7 mg/mL GAE）方能实现有效保护。该研究为利用农业工业残余物制备功能性MPN涂层、生产高活菌载量的干态微生物生物刺激素提供了概念验证，对可持续农业的发展具有重要推动作用。该论文发表于《Journal of Cleaner Production》。
