双糖脂工程化疫苗平台赋能递送途径定制，以拦截肿瘤肺转移

《Journal of Controlled Release》：Dual-glycolipid engineered vaccine platform empowers delivery route customization to intercept tumor lung metastasis

• 一种具有生物相容性、无 PEG 的 mRNA 平台 (SG-LNP)，共修饰唾液酸 - 二肉豆蔻酰甘油 (SA-DMG) 和单唾液酸四己糖神经节苷脂 (GM1)。
• 吸入式 SG-LNP 能诱发更强的肺部固有免疫和适应性免疫，安全性更好，与常规 P-LNP 相比，对黑色素瘤肺转移的预防效果更优。
• 静脉注射 SG-LNP 通过促进循环中抗原特异性 T 细胞的扩增，展现出比吸入给药更优的预防疗效，并实现了完全保护。

**引言**
转移是恶性进展的终末期和最致命阶段，癌症相关死亡主要由转移而非原发肿瘤引起 [1], [2]。肺部具有血气屏障薄、毛细血管网络复杂、血液灌注丰富以及固有的遗传易感性等特点，是多种恶性肿瘤血行转移的主要靶器官 [3], [4], [5]。肺转移是一个复杂的多步骤生物学过程：原发肿瘤衍生转移启动细胞 (MICs) 获得增强的侵袭潜能；随后循环肿瘤细胞 (CTCs) 内渗并进入血液系统性播散；接着，播散肿瘤细胞 (DTCs) 外渗、在肺实质中定植并最终增殖生长 [6], [7]。与原发肿瘤相比，转移灶通常体积微小且具有显著的空间异质性，使其难以通过手术切除和放疗治疗。虽然化疗对转移性肺癌有效，但会损伤正常细胞和组织，伴随严重的全身不良反应，极大限制了其应用 [8], [9]。近年来，mRNA 癌症疫苗已成为转移性癌症一种有前景的免疫治疗选择。mRNA 疫苗能够激活内源性适应性 T 细胞免疫反应以消除肿瘤细胞，在实现强效治疗效果的同时，表现出优于传统化疗的安全性特征。该策略为肺癌转移的预防和干预提供了创新且可行的方法 [10], [11]。

疫苗接种途径调节随后免疫反应的动力学和幅度 [12], [13]。肺部气道富含抗原呈递细胞 (APCs)，在抗原暴露后可快速激活组织驻留记忆 T (TRM) 细胞，触发肺部原位免疫反应 [14], [15]。因此，肺部吸入疫苗在靶向肺部病变方面具有独特优势，已成为抗转移治疗的研究热点 [16]。与吸入诱导的局部肺部免疫不同，静脉疫苗接种驱动全身抗肿瘤免疫。由于肺部肿瘤转移是一个涉及全身循环的复杂多步骤级联过程，mRNA 疫苗的局部肺部给药和全身给药作用于转移过程的不同环节，具有不同的时空特征（肺部组织与循环系统）[17], [18], [19]。遗憾的是，这两种给药方式之间的直接比较鲜有报道。最近的一项研究报告称，鼻内和静脉 circRNA-LNP 疫苗在治疗已建立的 B16-OVA 肺转移方面取得了相似的治疗效果，但其工作未能阐明这一现象背后的核心免疫机制 [20]。此外，目前尚无研究比较肺部局部给药和全身给药在预防性干预肺转移方面的疗效和免疫特征。在此背景下，明确局部肺部给药和全身给药各自的优势，对于优化 mRNA 疫苗疗效并实现对肺转移进展的精准干预至关重要。

尽管 mRNA 疫苗在广谱呈现肿瘤抗原方面具有无与伦比的优势，但其临床应用受到细胞渗透性差和极易受 RNase 介导降解的严重制约 [21], [22]。脂质纳米粒 (LNPs) 已成为 mRNA 疫苗的黄金标准递送平台，能够保护 mRNA 货物并促进其细胞内递送 [23]。然而，聚乙二醇 (PEG) 化脂质存在多种固有缺陷，严重损害其治疗效力。尽管确保了胶体稳定性，PEG 通过形成水合空间屏障赋予 LNPs“隐身”特性。这种遮蔽作用有效地使纳米颗粒免受免疫监视；然而，这也使它们在专业 APCs 面前几乎“隐形”。因此，树突状细胞 (DCs) 和巨噬细胞缺乏主动识别和吞噬，严重限制了下游免疫级联反应的启动 [24]。此外，静脉给药后，PEG 修饰的 LNPs 发生被动肝脏蓄积，无法靶向脾脏 APCs，从而阻碍全身免疫反应的诱导 [25]。更关键的是，最近的临床证据表明，PEG 并非免疫惰性；重复给药可触发抗 PEG 抗体的急剧激增，导致加速血液清除 (ABC) 现象和潜在的超敏反应 [26]。因此，迫切需要开发无 PEG 的 LNPs 平台以克服这种“隐身”屏障并实现对 APCs 的主动靶向，从而最大化疫苗疗效。此外，静脉给药能够靶向脾脏，这有助于研究局部肺部免疫和全身免疫在防御肿瘤肺转移中的作用。

唾液酸 (SA) 是一种九碳氨基糖，特异性结合 APCs 上的 Siglec-1 受体介导主动内吞 [27]。除了识别作用外，SA-脂质衍生物还被证明有助于内体逃逸并增强 APCs 内的 mRNA 翻译效率。尽管上述 SA-脂质偶联修饰显著增强了 APCs 特异性摄取，但作为唯一的 LNPs 稳定剂使用时，其相对较小的水合层往往导致胶体稳定性欠佳 [28]。相反，单唾液酸四己糖神经节苷脂 (GM1)——一种具有庞大五糖头基的天然糖脂——提供了坚固的水合壳，抑制纳米颗粒聚集，尽管由于其内部 SA 基团的空间屏蔽作用，其 APCs 靶向亲和力较低 [29], [30]。受这些互补特性的驱动，我们假设 LNPs 共修饰 SA-脂质偶联物和 GM1（称为 SG-LNP）将协同整合它们各自的优势，同时抵消其各自的局限性。这种双糖脂工程设计不仅旨在提供稳定的无 PEG 替代方案，还旨在显著放大专业 APCs 的识别和内化作用。我们设想，这种协调的相互作用将触发强烈的下游免疫级联反应，建立对抗肺部转移定植和进展的坚固防线。此外，SA 衍生物修饰的 LNPs 在静脉注射后可靶向脾脏 [28]，这也为阐明局部肺部给药（靶向肺部 APCs）与全身给药（靶向脾脏 APCs）在预防肿瘤肺转移中的作用奠定了基础。

为了验证这一假设，我们合成了 SA-DMG，并开发了一种共修饰 SA-DMG 和 GM1 的特征化双糖脂工程化 mRNA 平台 (SG-LNP)，具有可定制的递送途径。该设计旨在促进 SA-Siglec-1 轴介导的肺部 APCs（吸入）或脾脏 APCs（静脉）靶向，并促进高效的内体逃逸，从而协调涉及 DCs、巨噬细胞、自然杀伤细胞 (NKs) 和效应 T 细胞的多方面免疫反应。在 DC2.4 和 MH-S 细胞系中严格验证摄取、溶酶体逃逸和转染效率后，我们系统表征了 SG-LNP 在体内的生物分布、APCs 靶向特异性、免疫细胞激活和全身安全性。关键在于，我们将 SG-LNP 与传统的 PEG 化制剂 (P-LNP) 的预防疗效进行了基准比较，并进一步研究了局部和全身给药的免疫学后果。我们的研究揭示了一个令人感兴趣的差异：虽然肺部吸入 SG-LNP 诱导了强烈的局部免疫介导的肿瘤杀伤作用，但静脉注射激活了一个全身协调的“哨兵网络”，全面拦截肿瘤细胞的血行播散，从而实现了 100% 保护效力的完全肺转移预防。总之，这些发现为针对器官特异性转移预防的 mRNA 疫苗设计和递送提供了战略蓝图。

**章节片段**
**材料**
DLin-MC3-DMA、DPPC、胆固醇和 DMG-PEG 购自 AVT Co., Ltd.（中国上海）。SA 购自 Xiensi Co., Ltd.（中国天津）。DMG-NH2 由 Ruixi Co., Ltd.（中国西安）供应。GM1 购自 Huanrui Co., Ltd.（中国重庆）。增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) mRNA、Cy5 EGFP mRNA 和卵白蛋白 (OVA) mRNA 购自 APE×BIO Technology LLC.（美国德克萨斯州休斯顿）。DC2.4 和 MH-S 细胞系由 Binsui Co., Ltd.（中国上海）供应。
**SA-DMG 的合成与表征**
SA 本质上亲水，无法直接锚定在 LNPs 壳上。因此，必须将其与疏水基团偶联以促进制剂化。SA 的分子结构提供了多个潜在的修饰位点，包括 C1 位的羧基以及 C2、C4、C7、C8 和 C9 位的羟基。虽然以前的研究经常使用 C2 或 C9 羟基作为靶向肿瘤细胞或血管

**结论**
在本研究中，我们开发了一种共修饰 SA-DMG 和 GM1 的无 PEG mRNA 递送平台 (SG-LNP)，实现了可定制的组织靶向递送途径。SG-LNP 的双糖脂设计整合了 GM1 赋予的胶体稳定性与 SA-DMG 的 APCs 靶向能力。SG-LNP 可以靶向 APCs 上的 Siglec-1，显著增强细胞摄取和溶酶体逃逸，从而促进抗原表达并激活下游免疫反应。在肺部

**CRediT 作者贡献声明**
卢伟：撰写 – 初稿，可视化，验证，方法论，调查，概念构思。徐文雯：撰写 – 审校与编辑，可视化，验证，方法论，调查。张天：方法论。赵兴：方法论。赵宇涵：调查。张敬文：调查。孙思远：调查。吴兰：方法论。杨明仕：撰写 – 审校与编辑，监督，资金获取，概念构思。存冬梅：撰写 – 审校与编辑，

**出版同意书**
我们证明本文包含原创、未发表的工作，且未在其他地方考虑出版。此外，所有作者均已阅读并批准本文档的版本。

**伦理批准与参与同意**
所有动物实验均经沈阳药科大学动物实验伦理委员会批准，并按照美国国家卫生研究院 (NIH) 的《实验动物护理和使用指南》进行。

**资金**
本工作的经费支持来自深圳市高层次引进人才科研启动基金 (编号：6026330002K)、广东省教育厅研究项目 (编号：2025ZDZX2089)、中国国家自然科学基金 (批准号：82173768 和 82574355)、辽宁省盘登学者计划 (编号：XLYC2002061) 以及学科创新引智计划（“ 111 计划”）(编号：D20029)。

**利益冲突声明**
作者声明不存在已知的竞争财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文报告的工作。

**致谢**
我们要感谢 Ruixi Co., Ltd. 协助合成 SA-DMG。

卢伟 | 徐文雯 | 张天 | 赵兴 | 赵宇涵 | 张敬文 | 孙思远 | 吴兰 | 杨明仕 | 存冬梅