《Journal of Controlled Release》：Antitumor efficacy of PD-1 blocking antibody is enhanced through liposomal delivery and myeloid immune modulation
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针对PD-1免疫检查点的全身性单克隆抗体疗法（抗PD-1）在实体瘤患者中的有效率不足40%。除T细胞外，PD-1还表达于髓系群体，如单核细胞、树突状细胞、髓系祖细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞也具有与纳米颗粒相互作用的倾向。在此，研究人员开发了一种
针对PD-1免疫检查点的全身性单克隆抗体疗法（抗PD-1）在实体瘤患者中的有效率不足40%。除T细胞外，PD-1还表达于髓系群体，如单核细胞、树突状细胞、髓系祖细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些细胞也具有与纳米颗粒相互作用的倾向。在此，研究人员开发了一种脂质体抗PD-1制剂（LAP），以利用脂质纳米颗粒与巨噬细胞的相互作用，旨在增强抗肿瘤疗效。LAP表现出高效的抗体偶联和靶点结合能力，平均粒径为89 nm，静脉给药后伴随快速但短暂的循环促炎细胞因子升高。虽然在B16-F10黑色素瘤模型中，与载体相比，常规抗PD-1治疗导致肿瘤生长受到适度但不具统计学显著性的抑制，而LAP则显著抑制了肿瘤生长并提高了生存率，实现了67%的小鼠完全肿瘤排斥，而常规抗体治疗仅为17%。LAP将肿瘤免疫学环境重塑为免疫许可状态，表现为促肿瘤的M2型TAMs显著减少，以及细胞毒性T细胞与调节性T细胞的比例增加。髓系（CD11b+）细胞耗竭减弱了LAP的抗肿瘤疗效，但未显著改变其药代动力学，表明其抗肿瘤作用机制依赖于髓系细胞。结合LAP未增加全身毒性的数据，这些发现强有力支持LAP以及脂质体作为可增强PD-1阻断疗效的平台递送系统的临床转化。
研究背景与目的
PD-1/PD-L1免疫检查点阻断疗法革新了晚期黑色素瘤的治疗，但仅有约40%的患者能够实现疾病缓解。此外，由于PD-1的表达并不局限于肿瘤浸润T细胞，且免疫检查点通路的系统性阻断并非抗原特异性，超过80%的患者会出现免疫相关不良事件（irAEs）。因此，增强免疫疗法向肿瘤的递送以靶向PD-1轴，有望提高治疗效果并限制全身毒性。局部注射虽在临床前研究中展现出优越性，但在晚期和转移性黑色素瘤中因病灶播散和隐匿性转移而通常不可行。为解决这一挑战，研究人员开发了一种抗PD-1的脂质体制剂（LAP），利用肿瘤渗漏性血管被动靶向递送抗PD-1至肿瘤。脂质体是一种生物相容性好、毒性低的脂质双分子层囊泡，是临床上最成功的纳米颗粒药物递送平台之一。此前研究发现，脂质体优先在肿瘤和肿瘤引流淋巴结中积累，提示脂质体递送可增强PD-1阻断抗体的疗效。该研究发表于《Journal of Controlled Release》。
关键技术方法
- 1.
脂质体制备与抗体偶联：采用改良的标准薄膜水化法制备含马来酰亚胺功能化的脂质体，通过马来酰亚胺-硫醇反应将还原后的抗小鼠PD-1抗体（克隆：RMP 1-14）或IgG2a同型对照抗体（克隆：2A3）偶联至脂质体表面。
- 2.
表征技术：使用动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位；透射电子显微镜（TEM）结合免疫金标记和冷冻电镜（Cryo-EM）观察形态及抗体偶联。
- 3.
体内药代动力学与组织分布：在B16-F10荷瘤C57BL/6小鼠中进行静脉注射，通过ELISA检测血浆和组织中的抗PD-1浓度，并进行非线性回归两相消除分析。
- 4.
流式细胞术免疫表型分析：对脾脏和肿瘤组织制备的单细胞悬液进行多色流式细胞术分析，评估免疫细胞亚群变化。
- 5.
髓系细胞耗竭实验：腹腔注射抗CD11b抗体以耗竭CD11b+髓系细胞，验证其在LAP抗肿瘤疗效中的作用。
研究结果
3.1 LAP的表征
LAP通过直接偶联法生产，粒径均一（83–94 nm），PDI低（0.02–0.05），Zeta电位为-17至-24 mV。Cryo-EM显示圆形、双层单室脂质体，免疫金标记TEM确认了抗PD-1抗体成功偶联于表面。批间重现性好，抗体偶联效率为36%–72%，磷脂回收率为61%–77%。LAP保留了与PD-1的靶点结合能力，且在4°C下储存10天及血清稳定性研究中保持稳定。
3.2 LAP的药代动力学
常规抗PD-1呈单相消除，终末半衰期31.55小时。LAP呈双相消除，初始半衰期6.44小时，终末半衰期比常规抗体长25倍以上，分布容积更大。在96和120小时，LAP与常规抗体在肿瘤、肝脏和脾脏中的抗PD-1浓度无显著差异，但LAP在120小时的肿瘤/血浆和肝脏/血浆比值更高。
3.3 LAP诱导全身促炎细胞因子反应
LAP给药后2小时，循环中G-CSF、IL-21、TIMP-1、PF-4、GM-CSF和KC水平显著高于常规抗PD-1组，但这些差异在12小时后恢复至基线水平。这些细胞因子主要由巨噬细胞、树突状细胞、血小板、血管内皮细胞、自然杀伤细胞和成纤维细胞分泌，表明LAP触发了快速的先天免疫应答。
3.4 LAP体外诱导巨噬细胞极化
在IFN-β刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，LAP的摄取显著高于脂质体同型对照，并显著上调了M1标志物MHC-II和M2标志物CD206的表达，表明PD-1靶向增强了脂质体在PD-1阳性巨噬细胞中的内吞并诱导了极化。
3.5 LAP抑制肿瘤生长并延长总生存期
在B16-F10黑色素瘤模型中，LAP显著抑制肿瘤生长（p=0.029），而常规抗PD-1效果不显著（p=0.921）。LAP实现了67%的完全肿瘤消退，而抗PD-1和脂质体同型对照组均为17%。LAP是唯一显著延长生存期的治疗方案（p=0.017）。
3.6 LAP将外周免疫格局转向抗肿瘤免疫
LAP治疗后，脾脏中总CD11b+髓系细胞显著减少，尤其是中性粒细胞样祖细胞。尽管总巨噬细胞数无显著变化，但LAP几乎根除了促肿瘤的M2型巨噬细胞（CD206+MHC-II?），显著增加了抗肿瘤的M1型（CD206?MHC-II+）和中间表型巨噬细胞。LAP还显著增加了脾脏中CD8a+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞和NK细胞的比例，降低了FoxP3+调节性T细胞比例，并显著提高了细胞毒性T细胞与调节性T细胞的比例。
3.7 LAP诱导肿瘤免疫许可微环境
在肿瘤组织中，LAP降低了非白细胞（CD45?）上的PD-1表达。虽然总TAMs数量无显著差异，但LAP和抗PD-1均显著减少了M2型TAMs，增加了M1型和中间表型TAMs，且LAP效应更强，显著提高了M1/M2比值。LAP还显著增加了肿瘤浸润NK细胞。单剂量研究进一步证实，LAP改变了肿瘤浸润免疫细胞组成，增加了细胞毒性T细胞和NK细胞，减少了TAMs，并下调了TAMs上的PD-1和PD-L1表达。
3.8 髓系细胞贡献于LAP增强的抗肿瘤疗效
使用抗CD11b抗体耗竭CD11b+髓系细胞后，LAP的抗肿瘤疗效显著减弱，表现为肿瘤生长抑制和生存获益降低，而药代动力学未受显著影响，表明髓系细胞是LAP发挥疗效的关键效应细胞。
3.9 安全性与毒性
LAP治疗未观察到急性或慢性毒性，动物体重无显著差异。组织病理学检查未见中度或重度病变，仅LAP和抗PD-1组肝脏中可见单核细胞聚集，提示与PD-1抑制相关的免疫应答。血液学分析显示LAP组仅出现轻微的单核细胞比例升高和血小板计数降低，而抗PD-1组的血液学改变更为明显。所有LAP处理动物均无发病迹象。
讨论与结论
讨论部分指出，LAP的增强疗效可能源于脂质体载体增加了与髓系细胞和免疫蛋白的相互作用。LAP被PD-1阳性巨噬细胞内吞的程度高于对照脂质体，并在体内诱导了比常规抗PD-1更强的M2向M1巨噬细胞转变。CD11b+细胞耗竭实验证实了髓系细胞在LAP疗效中的关键作用。此外，脂质体可激活补体系统，其表面聚集的抗体Fc结构域可能更有效地诱导补体依赖的细胞毒性，从而引发促炎细胞因子释放。脂质体载体中的胆固醇成分可代谢为具有抗肿瘤和免疫调节活性的氧固醇，也可能贡献于疗效。
结论部分：研究人员证明了在鼠类黑色素瘤模型中，LAP相较于常规抗PD-1疗法的疗效提升，并确定了一个可能的髓系细胞依赖性作用机制。重要的是，LAP将外周和局部肿瘤免疫学环境重塑为抗肿瘤功能性，并将TAM重新极化为抗肿瘤表型。LAP重塑肿瘤微环境的能力可用于与其他免疫疗法（如其他检查点抑制剂、共刺激激动剂或基于细胞因子的疗法）的联合方案，在癌症及其他疾病中具有广泛的应用前景。
