Apoptin衍生肽B9通过HSPA1A–AP2B1轴限制神经元Ca2+超载缓解颞叶癫痫（TLE）

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Apoptin-Derived Peptide Alleviates Temporal Lobe Epilepsy (TLE) by Limiting Neuronal Ca2+ Overload Through the HSPA1A–AP2B1 Axis

　　

目的：确定凋亡蛋白（Apoptin）衍生肽（亦称B9）是否降低诱发性癫痫易感性以及海人藻酸（kainic acid，KA）相关认知与分子异常，并明确这些效应是否涉及热休克蛋白家族A成员1A（heat shock protein family A member 1A，HSPA1A）–衔接蛋白复合物2 β1（adaptor protein complex 2 beta 1，AP2B1）通路。
方法：在戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）诱导的急性癫痫模型和KA诱导的颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）模型中检查B9的治疗效能。进行脑电图（electroencephalographic，EEG）记录以评估癫痫样活动。采用Barnes迷宫测试评估癫痫小鼠的认知功能。采用Western blotting、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、免疫荧光（immunofluorescence，IF）和钙成像研究潜在机制。
结果：B9降低癫痫易感性，减弱癫痫样活动，并改善空间学习与记忆。HSPA1A在TLE相关数据集和实验模型中显著上调。B9抑制HSPA1A表达并破坏其与AP2B1的相互作用，从而恢复AP2B1的O-连接β-N-乙酰葡糖胺（O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰和蛋白稳定性，维持GluA2表达，并限制神经元Ca²⁺超载。敲低AP2B1消除B9对诱发性癫痫易感性、认知表现、GluA2丰度和神经元Ca²⁺超载的影响，而AP2B1过表达重现B9观察到的PTZ诱发性癫痫易感性和EEG活动降低。
结论：B9通过调节HSPA1A–AP2B1轴降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA相关认知和分子异常。这些发现支持B9作为TLE的潜在治疗策略。

研究背景：癫痫是全球公共卫生中五类优先关注的神经系统疾病之一，也是常见慢性神经系统疾病，约30%–40%患者发展为耐药性癫痫，其中颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是最常见且难治的亚型。海马硬化是TLE标志，涉及进行性结构重塑和持续网络高兴奋性，由复杂分子改变驱动，目前缺乏有效的疾病修饰性药物干预。现有抗癫痫发作药物多提供症状性控制，未改变潜在致癫痫过程，因此需要针对神经元高兴奋性核心驱动因子的疾病修饰策略。TLE中病理性神经元高兴奋性与突触受体重塑、钙稳态破坏和适应不良的翻译后信号有关。α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体亚基GluA2表达降低促进Ca²⁺通透性AMPA受体（Ca²⁺-permeable AMPA receptors，CP-AMPARs）形成，增加细胞内Ca²⁺内流并促进兴奋毒性。CP-AMPAR生成被认为是癫痫易感性和突触功能障碍的早期且持续贡献因素。然而，驱动CP-AMPAR重塑的上游应激相关机制尚不明确。热休克蛋白70（HSP70）家族作为分子伴侣调节蛋白折叠、稳定性和应激反应，其中热休克蛋白家族A成员1A（heat shock protein family A member 1A，HSPA1A）是神经元中主要应激诱导型胞质同种型，在细胞应激下强烈上调。既往研究提示HSP70蛋白在神经疾病中具有背景依赖性作用，但多数研究未区分同种型，针对HSPA1A在神经元信号中的机制研究有限；癫痫中仅有一项报道提示Hsp70可能通过促进Kv4–KChIP4a复合物降解而促进癫痫发作，但HSPA1A同种型是否特异参与突触重塑和癫痫进展尚未系统研究。Apoptin衍生肽（apoptin-derived peptide，ADP），亦称B9，由Apoptin活性片段和转录反式激活因子（trans-activator of transcription，TAT）细胞穿膜序列组成，最初作为抗癌药物开发，尤其用于胶质母细胞瘤，通过与其HSP70启动子内热休克元件相互作用抑制HSP70转录。研究人员前期胶质瘤原位异种移植模型中，B9给药与自发性癫痫样活动和癫痫样行为减少相关，提示其潜在抗癫痫发作活性。因此，研究人员在本研究中检验B9是否降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA相关认知和分子异常，机制上B9抑制HSPA1A表达，恢复突触受体稳态并限制应激信号驱动的病理性钙超载。

研究开展与结论意义：研究人员在PTZ诱导急性癫痫模型和KA诱导TLE模型中评估B9疗效，发现B9降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA相关认知和分子异常，同时调节HSPA1A–AP2B1信号和神经元Ca²⁺稳态。该研究将B9从抗癌领域扩展到神经疾病背景，并识别HSPA1A–AP2B1轴作为与诱发性癫痫易感性和KA相关认知/分子异常相关的应激信号通路，为B9作为TLE潜在治疗候选物提供机制依据。但研究未监测自发复发癫痫和癫痫慢性进展，因此不能解释为B9改变癫痫发生或病程。

关键方法概述（不超过250字）：研究人员使用人脑组织样本，来源于哈尔滨医科大学附属第二医院2024—2026年临床指征手术标本；6例耐药TLE海马硬化组织和6例创伤对照组织用于Western blotting，另3例非重叠耐药TLE海马硬化标本用于CoIP–MS。动物为成年雄性C57BL/6小鼠，建立KA脑室注射模型、PTZ累积挑战和急性PTZ/EEG记录，采用Racine量表评估发作严重程度，Barnes迷宫评估认知。生物信息学分析GSE256068中TLE-HS（n=64）与ControlCortex（n=14）。细胞实验使用原代海马神经元、N2a和HEK293细胞。主要方法包括AAV或shRNA介导的AP2B1过表达/敲低、Co-IP、CoIP–MS、CHX追踪、Western blotting、免疫荧光和Fluo-4钙成像。

研究结果：
3.1 B9降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA相关认知表现。在无KA暴露的独立队列中，累积PTZ挑战显示B9预处理小鼠首次达到Racine Stage IV/V所需PTZ注射次数显著增多；急性PTZ/EEG队列中，B9预处理显著降低预定10分钟PTZ后分析窗口内EEG包络平均振幅。在KA/Barnes迷宫队列中，KA处理小鼠目标导向导航受损，B9部分恢复搜索表现，缩短找到目标孔潜伏期并减少导航错误，总运动距离不变。研究人员因此认为，全身B9治疗降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA相关认知损害，且不影响一般运动活动。
3.2 B9抑制TLE中病理性HSPA1A上调。GSE256068差异表达分析显示，TLE-HS样本中HSPA1A较ControlCortex显著上调（log₂ fold change=1.34）。耐药TLE患者海马硬化组织较非癫痫创伤对照损伤颞叶皮层HSPA1A蛋白显著升高。KA诱导癫痫模型中，海马HSPA1A在KA后第3天至第30天持续显著升高，B9治疗显著降低其表达。免疫荧光显示KA后CA1和CA3区神经元核抗原（NeuN）阳性神经元及原代神经元中HSPA1A荧光强度显著增加，B9显著减弱该增加。GO和KEGG富集分析显示差异基因显著富集于神经元发育、钙信号、谷氨酸能突触及其他突触相关功能，提示Ca²⁺相关突触失调可能参与HSPA1A相关癫痫病理。
3.3 B9破坏HSPA1A–AP2B1相互作用并减轻癫痫性Ca²⁺超载。研究人员采用CoIP–MS鉴定HSPA1A相关蛋白，候选蛋白按强度比、独特肽段和评分过滤，富集于囊泡组织、突触囊泡循环和谷氨酸能突触；Reactome模块“含GluR2的AMPA受体转运”出现于通路分析中。STRING分析结合GRIA2中心互作网络显示，AP2B1与HSPA1A关联最密切，分子对接支持HSPA1A与AP2B1直接相互作用的结构合理性。免疫荧光显示HSPA1A与AP2B1在海马CA1、CA3区和原代神经元空间共定位。Co-IP定性显示KA后HSPA1A与AP2B1关联增强，B9后减弱。KA后海马AP2B1和GluA2蛋白水平显著降低，B9恢复AP2B1和GluA2表达并降低HSPA1A。免疫荧光显示KA后CA1、CA3区和原代神经元AP2B1表达降低，B9显著保留其表达。Fluo-4成像显示KA诱导原代神经元显著Ca²⁺超载，B9显著减轻。研究人员认为，HSPA1A与AP2B1相互作用并与AP2B1/GluA2破坏相关，B9中断该相互作用，保留AP2B1和GluA2表达并减轻神经元Ca²⁺超载。
3.4 AP2B1敲低消除B9介导的癫痫易感性、认知损害和神经元Ca²⁺失调改善。sh-AP2B1显著降低AP2B1表达。sh-AP2B1小鼠海马中AP2B1和GluA2显著降低，B9未显著恢复二者。累积PTZ挑战中，AP2B1敲低显著增加癫痫易感性，B9未显著增加达到Racine Stage IV/V所需PTZ注射次数；急性PTZ/EEG队列中，sh-AP2B1小鼠EEG包络平均振幅较B9处理组显著升高，追加B9未显著降低该参数。Barnes迷宫中，AP2B1缺陷小鼠潜伏期和导航错误显著增加，B9未显著挽救，总运动距离无显著差异。原代神经元中，AP2B1敲低显著加重KA诱导的Ca²⁺超载，B9未显著降低Fluo-4荧光。结论是AP2B1为B9对诱发性癫痫易感性、认知表现和神经元Ca²⁺稳态效应所需。
3.5 AP2B1过表达重现B9功能和分子效应。AAV介导的AP2B1过表达显著增加AP2B1蛋白。PBS条件下AP2B1过表达显著增加AP2B1和GluA2；KA处理后AP2B1和GluA2水平与sham组无显著差异，追加B9无显著进一步变化。累积PTZ挑战中，AP2B1过表达增加达到Racine Stage IV/V所需PTZ注射次数，提示癫痫易感性降低，联合B9无显著进一步效应。急性PTZ/EEG队列中，AP2B1过表达显著降低PTZ后10分钟EEG包络平均振幅，追加B9无显著进一步降低。Barnes迷宫中各组总距离、目标孔潜伏期和导航错误无显著差异。AP2B1过表达原代神经元中Fluo-4荧光在各处理条件间无显著差异。研究人员认为，AP2B1过表达重现B9对PTZ诱发性癫痫易感性和EEG活动的效应，而额外B9在AP2B1过表达条件下无显著进一步作用。
3.6 B9通过O-GlcNAc修饰稳定AP2B1以减轻神经元Ca²⁺超载。GeneCards分析提示AP2B1可能发生多种翻译后修饰，GlyGen注释进一步将O-GlcNAc修饰列为候选调节修饰，预测位点为Ser671和Ser672。KA处理显著降低海马O-GlcNAc转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和AP2B1表达，用Thiamet-G增强O-GlcNAc修饰显著恢复KA小鼠中二者表达，提示O-GlcNAc修饰促进AP2B1稳定性。原代神经元中Thiamet-G也显著减轻KA诱导的Ca²⁺超载。Co-IP显示AP2B1与OGT关联，KA降低AP2B1–OGT相互作用和AP2B1特异性O-GlcNAc修饰；B9恢复AP2B1与OGT关联并增加AP2B1 O-GlcNAc修饰。CHX追踪显示KA显著加速N2a细胞中AP2B1降解，B9显著延缓下降，提示AP2B1蛋白稳定性改善。研究人员因此认为，B9通过恢复AP2B1 O-GlcNAc修饰稳定AP2B1，从而有助于减轻神经元Ca²⁺超载。

讨论部分总结：癫痫发生由进行性突触重塑和适应不良细胞应激反应驱动，最终汇聚于神经元高兴奋性。B9全身治疗降低PTZ诱发性癫痫易感性并改善KA处理队列认知损害，将B9从抗癌药物扩展至神经疾病背景，并识别HSPA1A–AP2B1轴。既往研究描述HSPA1A在神经疾病中的双重作用：急性应激反应可能保护，而持续激活促进慢性病理。本研究中持续HSPA1A上调伴随HSPA1A–AP2B1关联增强、AP2B1和GluA2丰度降低及神经元Ca²⁺超载；B9降低HSPA1A，并与AP2B1和GluA2保留及Ca²⁺超载减轻相关。AP2B1是AP2网格蛋白介导内吞复合物组分，参与突触受体转运，并与阿尔茨海默病等神经精神疾病突触功能障碍有关。既往工作显示AP2B1敲低可通过损害雷帕霉素机械靶标（mechanistic target of rapamycin，mTOR）依赖性GluA2生物合成降低发育中大鼠海马神经元GluA2水平，但未直接检测CP-AMPAR电流。本研究中AP2B1敲低降低GluA2表达，AP2B1过表达保留KA处理后GluA2表达。O-GlcNAc修饰调节蛋白稳定性、应激适应和神经元信号，其减少与阿尔茨海默病和帕金森病相关，但在癫痫相关突触重塑中的作用尚不清楚。机制上，数据支持持续HSPA1A上调与AP2B1 O-GlcNAc修饰和稳定性降低相关；AP2B1敲低消除B9多项效应，而AP2B1过表达重现B9观察到的PTZ诱发性癫痫易感性和EEG活动降低。由于未直接测量CP-AMPAR电流，GluA2丢失与CP-AMPAR介导Ca²⁺内流之间的联系仍为推断性。B9增强AP2B1–OGT结合和AP2B1 O-GlcNAc修饰，并与AP2B1稳定性恢复、GluA2丰度保留及癫痫相关Ca²⁺失调减轻相关。约30%–40%癫痫患者对现有抗癫痫发作药物耐药；B9虽降低诱发性癫痫易感性，但目前应视为需进一步评估的机制导向候选物，而非已确立的疾病修饰治疗。累积PTZ挑战通过比较达到预定惊厥终点所需PTZ暴露量提供诱发性癫痫易感性的受控指标；由于PTZ主要通过抑制γ-氨基丁酸A型（GABA_A）受体介导神经传递诱发发作，该范式不测量自发发作产生。KA队列评估了KA后认知和分子异常，但未将急性KA诱导发作电生理特征化为癫痫持续状态（status epilepticus，SE），也未量化随后自发复发癫痫（spontaneous recurrent seizures，SRS）发生率和频率。因此，PTZ结果支持对诱发性癫痫易感性的抗癫痫发作效应，但未建立抗癫痫发生、疾病修饰或神经保护效应。未来需从急性KA损伤到慢性期进行连续video-EEG，以明确初始SE并确定KA后B9治疗是否改变SRS潜伏期、发生率、频率和持续时间。Costa et al.报道trilostane在KA诱导SE后不久连续给药6天，可延迟长期video-ECoG监测中电生理和惊厥性SRS发作，且trilostane未改变初始SE或海马神经元丢失，区别于急性抗癫痫发作或神经保护作用；慢性癫痫大鼠中7天trilostane疗程也被提示通过增强神经类固醇可用性减轻自发发作进展。trilostane增加内源性神经类固醇可用性，而B9作为HSPA1A–AP2B1–GluA2信号和神经元Ca²⁺稳态调节剂被研究。由于本研究未监测SRS，其发现不能直接与trilostane报道的抗癫痫发生或疾病修饰效应比较。局限包括：CP-AMPAR参与由GluA2丰度和细胞内Ca²⁺水平推断，未直接电生理测量或选择性药理学阻断；未鉴定具体AP2B1 O-GlcNAc修饰位点；体内实验仅纳入雄性小鼠；50 Hz EEG采样率无法可靠评估γ及更高频活动；人组织对照使用损伤颞叶皮层而非非癫痫海马，解剖区域和损伤背景可能影响HSPA1A差异。
研究结论翻译：总之，B9降低PTZ诱发性癫痫易感性，改善KA相关认知和分子异常，同时调节HSPA1A–AP2B1信号和神经元Ca²⁺稳态。这些发现为在癫痫模型中进一步研究B9提供机制依据，但未证明B9改变癫痫发生或慢性进展。在确立任何抗癫痫发生或疾病修饰活性前，需要纵向video-EEG监测自发复发癫痫。