睾酮经脊髓AR-PAX2+ GABA能中间神经元-GABAAR通路抑制GRPR+神经元瘙痒传递并参与瘙痒感知性别差异

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Spinal Mechanisms of Testosterone Involved in Itch Regulation

　　

背景与目的：临床和流行病学数据表明，雌性较雄性具有更高的瘙痒敏感性，既往研究已证实雌激素可加重瘙痒并驱动该性别差异。然而，睾酮作为主要雄激素，是否发挥抗瘙痒作用并参与瘙痒感知的性别差异仍不明确。因此，本研究有三个主要目标：（1）表征睾酮对雄性和雌性小鼠急性与慢性瘙痒的调控效应；（2）鉴定介导睾酮抗瘙痒作用的脊髓雄激素受体（androgen receptor, AR）表达神经元群体；（3）阐明睾酮抑制脊髓瘙痒传递的下游GABA能突触级联。

方法：本研究使用C57BL/6小鼠和GRPR-GFP小鼠。通过行为学测试评估外源性睾酮给药、睾丸切除（orchiectomy）、AR拮抗剂氟他胺（flutamide）和GABA_A受体（GABA_A receptor, GABA_AR）拮抗剂bicuculline对组胺（histamine）或氯喹（chloroquine）诱导的急性瘙痒、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB）诱导的慢性瘙痒，以及高架十字迷宫（elevated plus-maze, EPM）和旷场实验（open-field test, OFT）评估的焦虑样行为的影响。采用双重免疫荧光染色检测脊髓背角AR与PAX2的共定位。采用全细胞膜片钳电生理记录脊髓切片中GRPR⁺神经元的突触传递和兴奋性。

结果：睾酮参与小鼠瘙痒的性别差异。外源性睾酮抑制组胺或氯喹诱发的急性瘙痒，并缓解DNFB诱导的慢性瘙痒和焦虑样行为。睾丸切除增强瘙痒敏感性，而睾酮替代可逆转该效应。AR主要表达于脊髓背角浅层PAX2⁺ GABA能抑制性中间神经元。睾酮增加自发性抑制性突触输入并降低GRPR⁺神经元的兴奋性。睾酮的抗瘙痒效应可被鞘内注射氟他胺或bicuculline阻断。

结论：睾酮通过激活GABA能中间神经元上的AR，增强GABA释放，并随后通过GABA_AR抑制GRPR⁺神经元，从而在脊髓水平抑制瘙痒传递。睾酮作为内源性抗瘙痒激素，参与瘙痒感知的性别差异，为临床瘙痒治疗提供新靶点。

研究背景：瘙痒是引发抓挠欲望的感觉，从短暂皮肤刺激所致急性瘙痒到慢性持续性瘙痒。急性瘙痒作为进化保守的防御警报系统，可通过抓挠避免潜在刺激或提示潜在问题；慢性瘙痒常为系统性疾病症状，常导致睡眠障碍和情绪障碍，形成瘙痒与负性情绪互相加重的恶性循环。临床流行病学资料显示，女性瘙痒敏感性以及焦虑、抑郁障碍患病率通常高于男性，提示性激素可能参与。既往研究已证实雌激素促进瘙痒，是雌性小鼠较雄性瘙痒敏感性显著升高的关键因素。由此提出问题：主要雄激素睾酮是否也参与瘙痒性别差异并调控瘙痒感觉？目前缺乏系统实验研究。脊髓背角（spinal dorsal horn, SDH）是将瘙痒信号从外周传递至脑的主要中继中心，局部神经回路对信号调制至关重要。已建立的脊髓瘙痒传递通路为：外周刺激激活背根神经节中脑钠肽B（natriuretic peptide B, NPPB）阳性神经元，释放NPPB激活表达NPRA的脊髓胃泌素释放肽（gastrin-releasing peptide, GRP）能神经元，后者释放GRP兴奋SDH中胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor, GRPR）阳性神经元，从而将瘙痒信号从外周传至脊髓。GRPR阳性神经元再将瘙痒信号经脊髓投射神经元间接传至臂旁核，随后中继至丘脑等脑区，产生瘙痒意识感知。GRPR阳性神经元是首个鉴定的瘙痒特异性受体所在神经元，是脊髓瘙痒回路关键枢纽。基因敲除Grpr或选择性消融这些神经元可显著减少小鼠抓挠行为，故其是瘙痒传递与调制机制研究的核心。临床相关性方面，瘙痒性皮肤病女性患病率一般较高，约27%成人经历瘙痒，女性显著高于男性；慢性瘙痒严重损害生活质量并与焦虑抑郁密切相关；银屑病患者调查中61.3%有疾病相关瘙痒，女性患者慢性瘙痒症状负担显著大于男性。机制上，雌激素与ERα结合增强瘙痒感知，是女性更高瘙痒敏感性的主要驱动因素；雌二醇上调脊髓瘙痒介质GRP表达并增加GRPR阳性神经元对组胺反应性，鞘内注射GRPR拮抗剂可消除雌二醇促瘙痒作用。因此雌激素经脊髓GRP/GRPR系统选择性增强雌性小鼠瘙痒感知。但除雌激素促瘙痒外，瘙痒性别差异是否与睾酮等雄激素潜在抗瘙痒作用相关仍未知。睾酮是主要由雄性睾丸和雌性卵巢分泌的类固醇激素，属神经活性类固醇，调节5-羟色胺（5-HT）、多巴胺和γ-氨基丁酸（GABA）等神经递质系统，具镇痛、抗焦虑和抗抑郁特性，因此可能与雌激素共同参与瘙痒性别差异。基于此，研究人员采用形态学、行为药理学和电生理技术，研究睾酮对外周和脊髓水平瘙痒感知的影响，阐明受体机制和脊髓回路参与，并探索其是否改善瘙痒与焦虑共病，以期为临床瘙痒管理和靶向治疗提供新见解。

关键技术方法：研究人员使用C57BL/6小鼠和GRPR-GFP小鼠。C57BL/6小鼠来自空军军医大学实验动物管理中心；GRPR-GFP小鼠由美国圣路易斯华盛顿大学Zhou-Feng Chen教授提供。主要技术方法包括：行为学测试评估外源性睾酮、睾丸切除、AR拮抗剂氟他胺和GABA_AR拮抗剂bicuculline对组胺或氯喹诱导急性瘙痒、DNFB诱导慢性瘙痒及EPM/OFT焦虑样行为的影响；建立双侧睾丸切除模型并进行睾酮替代；鞘内给药；AR与PAX2双重免疫荧光染色；脊髓切片全细胞膜片钳记录GRPR⁺神经元突触传递和兴奋性。

研究结果：3.1 睾酮抑制正常雄性和雌性小鼠的急性瘙痒行为：通过行为学测试，研究人员发现腹部皮下注射睾酮可剂量依赖地抑制组胺诱导抓挠，1.0 mg剂量最大，1.5 mg未优于0.5 mg；1.0 mg睾酮还减少雄性氯喹诱导和雌性组胺诱导的急性瘙痒，表明外源睾酮在雄雌中均具抗急性瘙痒作用。3.2 去势雄性小鼠瘙痒敏感性增强，睾酮补充可逆转：通过双侧睾丸切除及睾酮补充实验，术后7天组间无显著差异，术后20天去势+橄榄油组组胺和氯喹诱导抓挠显著增加，1 mg睾酮替代将组胺反应恢复至假手术水平，并显著抑制氯喹反应，甚至低于假手术组；0.5 mg睾酮也降低组胺诱导抓挠，说明长期睾酮耗竭增强瘙痒敏感性，补充可逆转。3.3 鞘内注射AR拮抗剂氟他胺逆转睾酮抗瘙痒效应：通过鞘内给药行为学，单独睾酮减少组胺诱导抓挠，共同给予氟他胺后抓挠增加并消除睾酮抑制作用，单独氟他胺无显著影响，表明睾酮抗瘙痒由AR介导。3.4 睾酮抑制慢性瘙痒及相关焦虑样行为：通过DNFB慢性瘙痒模型、OFT和EPM，睾酮皮下给药显著减少雄性和雌性DNFB小鼠自发抓挠，雌性抑制更明显；雄性OFT总路程和中央区距离增加，EPM开臂时间百分比增加，开臂进入百分比无差异，表明睾酮减轻慢性瘙痒及伴随焦虑样行为。3.5 AR主要表达于脊髓背角浅层PAX2阳性神经元：通过双重免疫荧光染色，AR阳性胞体在SDH稀疏分布且浅层密度较高，PAX2阳性胞体大量集中于浅层，72.5% AR表达神经元与PAX2⁺抑制性中间神经元共定位，提示AR主要位于抑制性（可能GABA能）神经元。3.6 睾酮降低脊髓背角浅层GRPR⁺神经元兴奋性：通过GRPR-GFP小鼠脊髓切片全细胞膜片钳，5 μM睾酮不影响sEPSC频率和幅度，但增加sIPSC频率而不改变幅度；bicuculline消除睾酮诱导sIPSC频率升高；睾酮提高rheobase，氟他胺部分逆转；RMP和动作电位阈值无组间差异；表明睾酮不直接调控GRPR⁺神经元，而通过增强GABA能抑制输入间接降低其兴奋性，且GABA_AR信号和AR参与。3.7 GABA_AR拮抗剂bicuculline逆转睾酮抗瘙痒效应：通过鞘内给予bicuculline的行为学，睾酮预处理后，bicuculline组组胺诱导抓挠显著多于对照组，说明脊髓GABA_AR阻断完全消除睾酮抗瘙痒作用，支持睾酮经AR作用于抑制性神经元促进GABA释放，GABA作用于GABA_AR抑制GRPR⁺神经元。

讨论总结：讨论指出，全球临床和人群流行病学证据确认女性瘙痒患病率40.7%高于男性38.9%（p<0.001），提示瘙痒感知存在基本性别二态性，可能由雌二醇等性激素作用于脊髓瘙痒通路介导。虽然雌激素的促瘙痒调控功能已较清楚，但主要雄激素睾酮的调制作用此前大多未阐明。该研究提供综合证据表明睾酮是关键抗瘙痒因子并显著贡献性别差异。关键发现是睾酮抗瘙痒效应：外源睾酮显著抑制组胺和氯喹诱导急性瘙痒，雄雌一致，提示广泛治疗潜力；该作用特异经AR介导。为验证睾酮是否为瘙痒性别差异关键因素，研究人员进行去势和补充实验，发现瘙痒敏感性增强仅在术后20天而非7天显现，提示依赖残余睾酮逐渐耗竭；睾酮替代使去势雄鼠瘙痒敏感性正常化，确认其维持雄性较低瘙痒敏感性。在DNFB慢性瘙痒模型中，睾酮减少自发抓挠并改善相关焦虑样行为，间歇睾酮治疗甚至预防慢性瘙痒发展，提示预防应用。鉴于脊髓上瘙痒回路复杂和中枢神经元解剖转基因工具有限，研究人员聚焦SDH局部瘙痒传递和调制回路，特别是GRPR⁺神经元。电生理记录显示睾酮提高sIPSC频率和GRPR⁺瘙痒神经元动作电位阈值，降低其兴奋性；抗瘙痒活性完全依赖GABA_AR信号，因为bicuculline在体内和离体均完全消除该抑制效应；形态学染色证实AR主要位于浅层SDH PAX2⁺抑制性中间神经元。综合证据支持睾酮经AR作用于PAX2⁺ GABA能中间神经元，增强GABA_A依赖突触抑制，从而抑制GRPR⁺神经元瘙痒信号。作者总结机制：性别差异框架显示雌激素促进瘙痒而睾酮抑制瘙痒，睾酮经上述脊髓回路机制发挥作用；该发现建立激素调控与瘙痒感知之间明确联系，突出睾酮在行为和细胞水平抑制瘙痒的作用。研究结论翻译：睾酮通过激活GABA能中间神经元上的AR，增强GABA释放，并随后通过GABA_AR抑制GRPR⁺神经元，从而在脊髓水平抑制瘙痒传递；睾酮作为内源性抗瘙痒激素，参与瘙痒感知的性别差异，为临床瘙痒治疗提供新靶点。