解析曲霉侵染花生中黄曲霉毒素积累的跨尺度时空映射与代谢特征

《Journal of Hazardous Materials》：Deciphering Cross-Scale Spatiotemporal Mapping and Metabolic Signatures of Aflatoxins Accumulation in Aspergillus-Infected Peanuts

　　

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  跨尺度映射揭示了真菌感染和黄曲霉毒素积累的时空模式。
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  代谢指纹图谱解读了黄曲霉毒素形成过程中的动态响应。
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  机器学习实现了准确分类和黄曲霉毒素定量。
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  多模态融合推进了黄曲霉毒素污染的靶向监测。

引言

黄曲霉（Aspergillus flavus）是一种广泛分布于土壤及作物表面的丝状真菌，其最显著的特征是能够产生黄曲霉毒素（AFs）[1]。在这些毒素中，由产毒菌株产生的黄曲霉毒素B1（AFB1）具有强致癌性，已被国际癌症研究机构（IARC）归类为一类致癌物[2]。相比之下，非产毒菌株由于黄曲霉毒素生物合成簇中关键基因发生突变或缺失，不具备产毒能力，但仍可定殖宿主并占据生态位[3]。这一区别为将真菌感染与毒素产生解耦提供了独特框架，从而使针对与黄曲霉毒素生物合成特异相关宿主代谢响应的定向研究成为可能。

花生作为全球重要的油料和经济作物，极易感染并遭受黄曲霉损害，对消费者健康构成严重风险，包括增加肝癌发病率，同时也成为国际农业贸易中的重大技术壁垒[4]。值得注意的是，黄曲霉毒素的形成并非瞬时事件，而是一个随时间呈非线性变化的动态过程。研究表明，毒素的产生与真菌生长阶段、基质组成变化及代谢状态密切相关[5], [6]。因此，阐明黄曲霉毒素的生物合成机制及其时空积累模式是理解污染过程的基本前提，并为开发靶向快速检测策略提供了科学基础。

近红外高光谱成像（NIR-HSI）是一种无损分析技术，融合了近红外光谱与机器视觉的双重优势，能够同时获取包含空间分布信息和化学组成数据的代谢指纹图谱，实现对样品全面表征[7]。与UHPLC–MS/MS等传统化学分析方法相比，NIR-HSI具有无损、快速采集、高通量和可视化潜力等显著优势，特别适用于花生等农产品单粒检测与分选[8]。具体而言，高光谱成像系统可在数秒内完成花生籽仁的快速光谱采集与初步判别，显著提高分析通量[9]。其成像能力还可将光谱响应的空间变化转化为直观的可视化表征，用于分析籽仁组成的异质性[10]。除基于图像的判别外，NIR-HSI还能捕获近红外区域C-H、N-H和O-H等化学键的振动吸收特征，从而在宏观层面表征黄曲霉毒素及其相关代谢物（水、蛋白质、碳水化合物等）的时空分布[11]。总体而言，NIR-HSI能够实现高通量无损光谱监测，并提供花生感染黄曲霉后相关生化变化的宏观视图，为黄曲霉毒素污染的筛查与风险评估提供了快速分析平台。

质谱成像（MSI）是一种结合质谱分析与空间定位的先进分析工具，能够在组织或样品切片上直接获取二维空间分辨分子图谱[12]。与NIR-HSI相比，MSI可实现从宏观到微观的多尺度可视化分析，同时检测毒素与花生防御相关代谢物之间的空间关系，提供黄曲霉污染的全面代谢光谱指纹[13]。在众多MSI平台中，脱附电喷雾电离（DESI）和基质辅助激光解吸/电离（MALDI）代表两种互补的核心方法[14]。MALDI通过基质与分析物分子共结晶的能量转移实现高空间分辨率和灵敏度，特别适用于高分子量化合物（如脂质、多肽、防御蛋白）的成像分析[15]。而DESI的突出优势在于样品制备简便和近原位检测，最大限度地保留了毒素和内源分子的分布模式[16]。MALDI与DESI的成像组合可同时检测大分子代谢物和小分子毒素，涵盖高分辨率筛选与验证过程，为深入理解花生中黄曲霉毒素的动态积累模式提供了系统性见解。总之，MSI的高空间分辨率、分子特异性和多路成像能力凸显了其在分子层面阐明毒素与代谢物时空积累模式的潜力，从而为推进检测与控制技术提供了科学基础。因此，NIR-HSI与MSI的结合在空间和分子尺度上提供了互补信息：NIR-HSI在宏观层面实现对感染相关生化变化的快速、无损、高通量筛查，而MSI则在更精细的空间尺度上提供分子特异性和空间分辨信息，用于毒素和代谢物的定位与表征。由此，MSI可补充并验证NIR-HSI所识别的宏观模式，克服NIR-HSI分子特异性有限的不足[17]以及MSI相对费力且具有破坏性的特点[18]。两种模态的整合实现了对黄曲霉污染的多尺度可视化，将宏观感染模式与微尺度分子分布及代谢响应联系起来。

随着数据科学的进步，机器学习（ML）有望成为解读高维光谱和质谱数据的关键技术，并推动其在黄曲霉毒素检测领域的应用[19]。在图像处理领域，ML为图像信息融合提供了新维度，在一定程度上解决了涉及背景噪声、样品边界和感兴趣区域的分割难题[20]。在模型构建方面，ML技术将高维非线性光谱和图像特征转化为可解释的算法参数，有望建立定性和定量模型，实现对花生中黄曲霉毒素污染水平和真菌毒素含量的实时监测与早期预警[21]。此外，在代谢组学分析领域，ML可显著增强代谢物注释的覆盖率和准确性，为从复杂质谱数据中阐明毒素积累背后的代谢机制提供了有力工具[22]。总之，ML增强了从光谱降噪到模型预测的分析能力，并进一步实现了多模态数据的深度整合，从而为阐明花生中黄曲霉毒素及其代谢物的时空分布和动态积累模式开辟了新途径。

本研究旨在可视化花生中黄曲霉及其黄曲霉毒素的时空分布模式，并动态识别花生抗感染的时空特异性代谢响应指纹。通过整合NIR-HSI、MSI和uHPLC-MS/MS与ML技术，本研究建立了将宿主代谢响应与毒素积累相联系的跨尺度机制框架。本研究为黄曲霉毒素污染的机制阐明、快速检测和精准防控提供了全面的技术与理论基础，深化了对花生-黄曲霉互作分子机制的理解，并支持无损在线监测。

章节摘要

花生取样与接种

本研究所用的花生样品（品种：实龙）由黑龙江省谷泰旺生态农业有限公司生产（46.30°N, 129.57°E）。花生籽仁在4°C下储存直至使用。所用菌株为产毒黄曲霉（CGMCC 3.6304，CGMCC，中国）和非产毒黄曲霉（CICC 2476，CICC，中国）。菌株在实验前于4 ℃菌株库中保存。所有实验操作均在生物安全柜中进行。

uHPLC-MS/MS分析黄曲霉污染时间进程

通过目视检查，所有接种花生均表现出一致的渐进性感染过程。最初，未见明显菌丝、颜色变化或质地显著变化；随后，白色菌丝出现，逐渐由黄绿色变为深绿色，伴随菌丝絮状化和基质软化（图S4）。为准确测定花生样品中黄曲霉毒素的含量和变化，本研究采用uHPLC-MS/MS作为参考方法。

结论

本研究通过整合uHPLC-MS/MS、NIR-HSI、MSI和ML技术，系统阐明了黄曲霉感染的指纹代谢特征及黄曲霉毒素积累模式。可视化结果表明，在真菌入侵过程中，真菌毒素积累优先发生在花生表皮的两个特定区域，并在48小时后呈现激增积累模式。此外，代谢组学分析揭示了脂质代谢的时间阶段性。

研究意义

花生中黄曲霉毒素污染仍是严峻的食品安全挑战，然而对毒素出现时空模式的缺乏理解限制了有效的早期预警和靶向干预策略。本研究建立了整合近红外高光谱成像、质谱成像和机器学习的跨尺度分析框架，以解码黄曲霉感染、空间毒素积累和代谢动态之间的相互作用。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（32402218）、东南大学启动基金（RF1028624014）、中央高校基本科研业务费（东南大学芝山青年学者项目（2242025RCB0052））以及江苏省科技界青年科技人才托举工程（JSTJ-2024-126）的资助。

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