CRISPR-Cas9编辑STAT6或NF-κB p50/STAT6构建IL-4抗性促炎人CD34+髓系细胞用于癌症免疫治疗

《Molecular Oncology》：Engineering IL-4 resistant proinflammatory human myeloid cells for cancer immunotherapy

过继转移促炎髓系细胞可增强抗肿瘤T细胞应答，并限制小鼠模型中的肿瘤生长。既往研究已确定转录因子核因子κB p50（NF-κB p50）和信号转导与转录激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）是关键调节因子，其失活可增强小鼠髓系细胞的炎症潜能。在本研究中，研究人员将小鼠研究发现转化至人类细胞，并建立从人骨髓来源CD34⁺造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）生成促炎髓系细胞的方法。利用CRISPR-Cas9，研究人员破坏了NFKB1、STAT6、NFKB1与STAT6两者，或NFKB1与NFKB2（编码NF-κB p52），实现了靶蛋白的稳健缺失。研究人员确定了扩增HSPCs并将其分化为单核细胞的条件。为评估免疫抑制条件下的促炎潜能，将编辑后的单核细胞分化为巨噬细胞，暴露于白细胞介素4（interleukin 4，IL-4），并分析基因表达。RNA测序（RNA sequencing，RNA-Seq）显示，在STAT6缺陷和p50/STAT6缺陷巨噬细胞中促炎通路激活增强，但在p50缺陷或p50/p52缺陷巨噬细胞中未增强。转录组分析通过测量部分炎症介质的蛋白分泌得到验证。这些发现建立了一种生成具有癌症免疫治疗潜在临床应用价值的促炎人髓系细胞的策略。未来需要临床评估以确定STAT6-IMC（immature myeloid cells，IMC）或p50/STAT6-IMC是否表现出更优的治疗疗效。

研究背景：肿瘤微环境分泌趋化因子招募循环单核细胞，并通过白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）、IL-10、转化生长因子β（TGFβ）等细胞因子将其极化为免疫抑制性肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）。这些抑制性TAM损害T细胞效应功能、刺激血管生成并支持转移；促炎TAM则增强抗肿瘤免疫并与良好临床结局相关。目前将巨噬细胞从免疫抑制转向促炎的方法多集中于调节细胞因子和信号通路，但受肿瘤驱动抵抗、巨噬细胞可塑性和持久表型转化困难限制。靶向强化免疫抑制程序的转录因子可从源头更稳定重编程炎症反应。既往小鼠研究确定核因子κB p50（NF-κB p50）和信号转导与转录激活因子6（STAT6）为关键调节因子，其失活增强小鼠髓系细胞炎症潜能；p50缺失未成熟髓系细胞（immature myeloid cells，IMC）过继转移联合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5FU）可减缓小鼠肿瘤，但肿瘤最终进展。因此研究人员将小鼠发现转化至人细胞，建立人骨髓CD34⁺造血干/祖细胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）平台，评估p50、STAT6、p50/p52、p50/STAT6靶点，以生成抵抗IL-4的促炎人髓系细胞用于癌症免疫治疗。

研究人员开展了以下研究：利用CRISPR/Cas9编辑人骨髓CD34⁺ HSPCs，破坏NFKB1、STAT6、NFKB1与STAT6、或NFKB1与NFKB2（编码NF-κB p52），建立扩增和髓系分化条件，将编辑单核细胞分化为巨噬细胞，在IL-4下分析基因表达和蛋白分泌。结论：STAT6缺失或p50/STAT6双缺失的巨噬细胞在IL-4下呈现增强的促炎通路激活，而p50或p50/p52缺失不表现广泛促炎激活；两种编辑策略均抵抗IL-4免疫抑制但转录谱不同。意义：建立生成IL-4抗性促炎人髓系细胞的策略，具有癌症免疫治疗临床转化潜力。

关键技术方法（不超过250字）：人骨髓样本来自正常供者异基因骨髓移植剩余物（2019年3月至2026年7月），经约翰霍普金斯大学IRB批准（IRB00127577），获书面知情同意。主要方法：CD34⁺ HSPC无血清扩增；CRISPR/Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）电转编辑NFKB1、NFKB2、STAT6；单核细胞集落刺激因子（monocyte colony-stimulating factor，M-CSF）诱导单核细胞，人AB血清诱导黏附巨噬细胞，IL-4极化；流式细胞术；RNA测序（RNA sequencing，RNA-Seq）与基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）；定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）；Luminex蛋白检测；吞噬实验；CRISPR编辑推断（inference of CRISPR editing，ICE）。

研究结果：
人骨髓CD34⁺细胞扩增及髓系细胞生成：通过比较无血清扩增培养基中加入SR-1、UM171或两者，发现SR-1和UM171联合使CD34⁺细胞扩增最大并最佳保留CD34⁺CD38^?干/祖细胞亚群；IL-6去除在部分供者降低扩增。比较M-CSF与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF），M-CSF显著促进CD11b和CD14表达，因此选M-CSF诱导向单核细胞分化。
CRISPR/Cas9 sgRNA删除NFKB1、NFKB2和STAT6：通过设计成对小向导RNA（small-guide RNAs，sgRNA），NFKB1 sg6A+sg6C、NFKB2 sg6A+sg6B、STAT6 sg9A+sg9C分别实现100%插入缺失效率，DNA测序确认预期缺失和移码，Western blot显示p50及其前体p105、p52、STAT6蛋白高效缺失。
基因编辑人骨髓CD34⁺细胞的扩增与髓系分化：通过比较不同编辑细胞扩增，发现NT编辑细胞增殖最高，p50或STAT6单缺失扩增约低2倍，双缺失更低；转至M-CSF后扩增差异消失，CD11b⁺CD14⁺单核细胞成熟速率相似，第3天约30%、第4天约58%、第5天约76%，CD34⁺CD38^?比例下降；IL4R、IFNγR、FcγR1保留，FcγR3低表达；p50缺失降低CD11b几何平均荧光指数（geometric mean fluorescence index，GMFI），但CD14不变。
STAT6缺失促进IL-4中巨噬细胞促炎基因表达：通过RNA-Seq比较IL-4下NT与编辑巨噬细胞，热图显示STAT6和p50/STAT6缺失有显著转录程序改变，p50或p50/p52改变较小；GSEA显示STAT6和p50/STAT6缺失富集干扰素α应答、干扰素γ应答、TNFα通过NF-κB信号、炎症反应、IL6_JAK_STAT3信号等Hallmark炎症通路；KEGG和基因本体（gene ontology，GO）分析一致；STAT6缺失还富集细胞周期相关通路；使用促炎M1基因集，STAT6缺失标准化富集分数（normalized enrichment score，NES）=2.29，p50/STAT6缺失NES=2.20，但直接比较p50/STAT6与STAT6为NES=?1.42，提示额外p50缺失部分减弱M1程序；18个IL-4诱导M2基因中15个在两种缺失中显著降低。
基因编辑巨噬细胞的靶向验证与功能评估：通过qRT-PCR验证IL-6、CXCL10、TNFα、IL1b、IL-12b表达，Luminex检测蛋白，发现STAT6和p50/STAT6缺失增加IL-6和CXCL10分泌，p50单独不影响；TNFα和CXCL9部分样本低于检测下限（lower limit of detection，LLoD），估计增加；流式检测MHCI、MHCII、CD80、CD86，在IL-4下表达频率保留，p50/STAT6缺失GMFI轻度降低；吞噬实验显示各基因型巨噬细胞对GD2抗体调理的SK-N-DZ神经母细胞瘤细胞吞噬无显著差异，FcγR1保留。结论：STAT6和p50/STAT6缺失促进促炎表型并保留抗体依赖吞噬。

讨论部分总结：研究建立可扩展平台，从CD34⁺ HSPCs生成基因编辑人髓系细胞，实现≥96%的NFKB1、NFKB2、STAT6缺失且不损害髓系分化；编辑细胞保留IL4R、IFNγR、FcγR1，支持响应肿瘤微环境和抗体靶向。STAT6或p50/STAT6缺失在IL-4下产生强促炎表型并抑制M2基因，与小鼠Stat6^?/?数据一致。p50单独或p50/p52缺失在IL-4下未广泛激活炎症，可能因IL-4不能完全模拟肿瘤微环境。M1基因集分析显示两种缺失模式不同，STAT6缺失强促炎，p50/STAT6缺失部分转录本减弱、部分增加。细胞周期富集未增加增殖。抗原呈递通路转录改变，但表面蛋白频率保留。吞噬功能保留。无法预测STAT6-IMC或p50/STAT6-IMC优劣，需临床评估。小鼠中疗效T细胞依赖，未来需MHC匹配共培养研究。若促炎因子分泌为主要机制，可改造为通用型异体免疫治疗。CD34⁺细胞30天可扩增10000倍，结合肿瘤靶向抗体或CAR、检查点阻断、抗CD47等可能增强疗效。

研究结论部分翻译：总之，研究人员建立了一个可扩展平台，用于从CD34⁺造血干/祖细胞生成基因编辑人髓系细胞。STAT6缺失，单独或与NF-κB p50一起缺失，促进整体促炎表型并减少IL-4诱导的免疫抑制基因表达，同时保留髓系分化和抗体依赖性肿瘤细胞吞噬。尽管两种基因型均抵抗IL-4介导的免疫抑制，但其不同的转录谱提示治疗功能可能存在重要差异。p50缺失在IL-4中诱导若干促炎细胞因子的表达，并且既往显示可在小鼠中减缓肿瘤生长。这些发现支持STAT6和p50/STAT6缺失作为工程化IL-4抗性人髓系细胞用于针对人类恶性肿瘤的过继细胞免疫治疗的方法。