采用蛋白G富集方法的液相色谱-串联质谱法对人血清中度普利尤单抗的定量分析

《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：LC-MS/MS Method for Quantification of Dupilumab in Human Serum Using Protein G Enrichment

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  本研究开发了一种基于Protein G磁珠的LC-MS/MS方法，用于人血清中度普利尤单抗的定量分析
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  替代肽SGQSPQLLIYLGSNR实现了灵敏且特异性的靶向检测（定量下限LLOQ为1.00 μg/mL）
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  在较宽动态范围（1.00–400 μg/mL）内获得了优异的线性、精密度和准确度
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  临床谷值样本中观察到显著的个体间差异，支持药物浓度监测（TDM）指导下的个体化给药方案

引言

度普利尤单抗是一种全人源IgG₄单克隆抗体（mAb），通过与人白细胞介素-4受体α（IL-4Rα）亚基结合发挥治疗作用，从而阻断IL-4和IL-13的信号传导——这两种细胞因子是2型炎症的关键和核心驱动因素[1]、[2]、[3]。该药已获批用于治疗中重度特应性皮炎（AD）、哮喘、伴鼻息肉的慢性鼻窦炎及嗜酸性粒细胞性食管炎[4]、[5]。

尽管度普利尤单抗通常采用600 mg负荷剂量，随后每两周（Q2W）给予300 mg维持剂量，但在临床实践中，减少剂量或延长给药间隔的做法日益受到探索，以提高患者便利性和降低长期治疗成本。Spekhorst等人近期的一项前瞻性研究表明，将注射间隔延长至每六周（Q6W）一次，可在病情控制良好的AD患者中维持疾病控制[6]。然而，Dekkers等人后续的研究揭示了此类间隔延长过程中存在一个关键的"生物学转折点"[7]。具体而言，当给药间隔从Q4W延长至Q6W（约注射后40天）时，血清度普利尤单抗浓度显著下降，导致循环淋巴细胞上可检测到的IL-4Rα重新出现。这一变化伴随着大多数患者的湿疹面积及严重程度指数（EASI）评分轻微升高，以及2型生物标志物（包括TARC和IL-13）水平升高[7]。这些发现强调了血清药物浓度、靶点饱和与临床反应之间直接且非线性的关系。这种关联使得度普利尤单抗的治疗药物监测（TDM）不仅是一种研究工具，更是指导个体化治疗的实用临床手段。TDM有助于识别个体药物浓度降至饱和阈值以下的"转折点"，指导个性化给药间隔调整，并区分真正的治疗失败与因加速清除导致的药物暴露不足。为支持这些应用，需要一种稳健的方法用于临床上准确定量度普利尤单抗浓度。

传统上，酶联免疫吸附测定（ELISA）一直是定量治疗性单克隆抗体的金标准[8]、[9]、[10]、[11]。然而，配体结合 assays（LBAs）常受限于动态范围较窄、开发周期长、潜在交叉反应以及抗药抗体干扰等问题[12]、[13]、[14]。相比之下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）具有更高的特异性、更宽的线性动态范围以及多重分析能力[15]、[16]、[17]、[18]。"自下而上"的蛋白质组学方法——即将单克隆抗体消化为独特的替代肽——是最常用的LC-MS/MS策略。然而，对全部蛋白质分析物进行无差别的蛋白水解消化会产生大量肽段，其中某些肽段的浓度远高于目标替代肽的浓度。由于基质肽段与替代肽段通常具有相似的理化性质，直接注射消化后的样品可能导致共洗脱，从而降低检测灵敏度[19]。此外，长期使用还可能引起色谱柱压力过高。因此，血清基质的复杂性构成了重大挑战，需要有效的样品净化步骤。利用Protein A或Protein G进行通用亲和捕获已被证明能有效富集IgG型抗体并减少基质干扰[20]、[21]、[22]。然而，利用通用Protein A/G作为血清中LC-MS/MS定量度普利尤单抗的前处理工具，目前尚未见报道。

本研究开发了一种灵敏、特异且稳健的LC-MS/MS方法，用于人血清中度普利尤单抗的定量分析，以支持TDM和个体化给药。该方法结合了简便的Protein G磁珠富集和LC-MS/MS分析。选择来自度普利尤单抗互补决定区（CDR）的替代肽SGQSPQLLIYLGSNR作为定量肽，该肽与内源性人血清蛋白无同源性。本方法测定的是度普利尤单抗总浓度，不受抗药抗体（ADA）干扰。在抗药抗体（ADA）存在的情况下，Protein G富集步骤可同时捕获游离的度普利尤单抗以及与ADA结合的度普利尤单抗（通过治疗性抗体的Fc区），后续的胰蛋白酶消化无论结合状态如何均可释放替代肽。尽管该总量法为ADA阳性患者提供了可靠的药物总暴露量衡量，但无法区分游离（活性）药物与ADA结合（可能无活性）药物部分。对于ADA滴度高的患者，该总浓度可能高估了具有药理活性的药物浓度。然而，具有临床意义的度普利尤单抗抗药抗体较为罕见（成人中持续ADA阳性率≤3.7%）[23]；且当免疫原性发生率较低时，总抗体测定法被认为是常规TDM的充分手段。

各节摘要

化学品与材料

度普利尤单抗参比标准品（6.9 mg/mL）由阿拉丁（上海，中国）提供。肽段LSITIRPR（L8R）、SGQSPQLLIYLGSNR（S15R）、QKSGQSPQLLIYLGSNRAS（Q19S）以及稳定同位素标记（SIL）内标（IS）SGQSPQLL*IYLGSN*R（含I-¹³C₆,¹⁵N和R-¹³C₆,¹⁵N₄）由中国肽业公司（上海，中国）合成。胰蛋白酶（测序级）购自Promega（威斯康星州麦迪逊市，美国）。二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）和碳酸氢铵（NH₄HCO₃）购自

替代肽的选择

选择独特且稳定的替代肽对于确保基于LC-MS/MS分析的特异性至关重要。与常规蛋白不同，单克隆抗体由可结晶片段（Fc）和抗原结合片段（Fab）组成，其中位于Fab结构域内的互补决定区（CDR）在抗体多样性中起关键作用。本研究从Drugbank数据库检索了度普利尤单抗重链和轻链的氨基酸序列

结论

总之，我们开发并全面验证了一种灵敏、特异且稳健的LC-MS/MS检测方法，用于人血清中度普利尤单抗的定量分析。该方法整合了Protein G磁珠富集以有效降低基质复杂性，并采用替代肽SGQSPQLLIYLGSNR进行靶向检测，实现了1.00 μg/mL的定量下限和优异的精密度——其性能特征非常适合TDM应用。重要的是，鉴于血清度普利尤单抗浓度与

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刘亮：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿撰写，验证，获取资助，概念构思。吴建华：撰写 – 审阅与编辑，方法学，形式化分析，数据整理。杨坤：撰写 – 初稿撰写，方法学，形式化分析，概念构思。杨承铭：撰写 – 审阅与编辑，验证，方法学。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报道工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到湖北省青年科技人才晨光提升计划（202303）、中国药师协会医院药学专业委员会（编号：CPAZ05-ZC-2022-002）、武汉大学中南医院青年交叉学科专项基金（ZNQNJC2023010）以及贝赛医学基金会的支持。

Kun Yang|Jianhua Wu|Chengming Yang|Liang Liu