Elamipretide通过维生素B6-VEGF轴恢复衰老卵母细胞质量与雌性生育力的机制研究

《Aging Cell》：Elamipretide Rejuvenates Oocyte Quality and Restores Female Fertility During Reproductive Aging

　　

衰老是导致雌性生育力下降的主要因素，而卵母细胞质量是卵巢老化的核心决定因素，也是不孕症的关键原因。尽管已有若干具有抗衰老活性的天然化合物被报道，但逆转卵巢衰老的高效策略仍然匮乏。本研究报道，多肽elamipretide能够在母体衰老过程中维持卵巢功能并保持雌性生育力。研究人员发现，给予elamipretide可增加老龄小鼠的产仔数，并改善卵母细胞质量的衰退。代谢组学和转录组学分析显示，注射elamipretide后，老龄卵母细胞中多个生物学过程得到显著恢复。Elamipretide改善了老龄卵母细胞的核成熟与胞质成熟，同时增强了细胞骨架动力学、线粒体代谢及细胞器重组。在机制上，elamipretide通过协同激活维生素B6-VEGF轴减轻了与年龄相关的卵母细胞成熟缺陷。此外，elamipretide显著促进了老龄人卵母细胞的成熟、受精和卵裂。Elamipretide处理还挽救了氧化损伤下猪卵母细胞的发育能力。综上，本研究鉴定了一种新的针对衰老相关不孕症的多肽治疗候选药物，表明elamipretide通过激活VEGF信号通路协同促进核成熟与胞质成熟，从而恢复衰老卵母细胞的质量以实现生育力提升。

研究背景与科学问题

随着女性生育年龄推迟，高龄产妇（AMA）比例持续上升。高龄与流产、早产、胎儿生长受限（FGR）及染色体异常等不良妊娠结局密切相关。卵母细胞质量随年龄增长而下降是卵巢衰老的核心标志，也是导致高龄女性生育力降低的重要原因。卵母细胞成熟包括核成熟（即减数分裂恢复与染色体分离）和胞质成熟（涉及mRNA、蛋白质及底物的积累，为后续受精与胚胎发育提供保障）。衰老诱导的胞质成熟失败与线粒体功能障碍、活性氧（ROS）升高、钙稳态失衡及细胞骨架异常密切相关。现有干预策略如小分子抑制剂（CD38抑制剂78c）、天然提取物（褪黑素、亚精胺）及线粒体靶向抗氧化剂（MitoQ、SkQ1、辅酶Q10、烟酰胺单核苷酸NMN）虽有一定效果，但仍存在靶向效率低、生物利用度差等问题。因此，亟需探索更安全、易吸收的小分子制剂用于临床转化。Elamipretide是一种细胞膜穿透性芳香族阳离子四肽，能够选择性结合心磷脂、稳定线粒体内膜结构、提高电子传递链效率、减少ROS产生，并在多种衰老模型中展现出保护作用。然而，其能否逆转雌性生殖衰老尚不清楚。为此，研究人员系统探究了elamipretide对衰老卵母细胞质量和雌性生育力的影响及其潜在分子机制。

主要技术方法概述

研究人员采用以下关键技术：（1）动物模型：选用ICR品系雌性小鼠（8、10、12月龄作为老龄模型，6–8周龄作为年轻对照）；（2）人类卵母细胞来源：从广西妇幼保健院接受卵胞浆内单精子注射（ICSI）的患者中收集生发泡期（GV）卵母细胞，按年龄分为高龄组（≥35岁）和年轻组（<35岁）；（3）猪卵母细胞体外成熟体系：从屠宰场获取性未成熟母猪卵巢进行体外培养，并以H₂O₂诱导氧化应激模型；（4）代谢组学与转录组学联合分析；（5）免疫荧光染色与共聚焦显微镜观察；（6）实时定量PCR（qPCR）与蛋白免疫印迹（Western blotting）。

研究结果

3.1 短期Elamipretide处理改善老龄小鼠生育力

研究人员首先确立了最优给药方案：腹腔注射5 mg/kg/day连续7天。该方案显著增加了10月龄老龄小鼠的排卵数和优势卵泡数量，提升了体外受精率，并有效恢复了2-细胞到4-细胞胚胎的发育进程，表明elamipretide可恢复老龄小鼠的优势卵泡储备并改善生育力。

3.2 Elamipretide重塑老龄小鼠卵巢维生素B₆代谢

代谢组学分析显示，elamipretide处理使老龄卵巢中250种差异累积代谢物中的11种恢复到接近年轻水平。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析揭示维生素B₆代谢通路显著改变。直接补充维生素B₆可完全逆转老龄卵母细胞的第一极体排出障碍，而其他代谢物（L-乙酰肉碱LAC、氨基戊酸AVA）无效。

3.3 Elamipretide改变老龄小鼠卵母细胞整体转录水平

转录组分析发现，与年轻组相比，老龄卵母细胞中有829个基因差异表达；elamipretide处理后，有2081个基因发生改变，其中518个基因为两组共有。基因本体论（GO）富集分析显示elamipretide缓解了膜结合细胞器及脂质转运与代谢的改变。KEGG分析表明血管内皮生长因子（VEGF）信号通路在老龄卵母细胞中显著变化，并被elamipretide逆转。

3.4 Elamipretide促进老龄卵母细胞细胞骨架动力学与纺锤体迁移

免疫荧光结果显示，elamipretide恢复了老龄卵母细胞异常的纺锤体组装和染色体排列，恢复了γ-微管蛋白在纺锤体极部的定位，提高了乙酰化微管蛋白水平以稳定微管，并修复了胞质肌动蛋白网络组装。蛋白免疫印迹证实elamipretide恢复了ROCK1/2的表达。

3.5 Elamipretide缓解老龄卵母细胞中线粒体驱动的氧化应激

GO分析显示差异表达基因富集于线粒体内膜组织、线粒体代谢和氧化应激反应。Elamipretide恢复了线粒体在纺锤体周围的正常分布，将过高的三磷酸腺苷（ATP）合成降至生理水平，部分恢复了线粒体DNA拷贝数，提高了线粒体膜电位（MMP），上调了DRP1表达，降低了ROS水平，但对凋亡信号仅表现出部分缓解趋势。

3.6 Elamipretide恢复老龄卵母细胞细胞器相关过程

Elamipretide恢复了高尔基体功能标记Rab10和GM130的表达，将内质网重新定位至纺锤体周围区域，上调了内质网应激标记GRP78的表达，恢复了溶酶体的均匀胞质分布模式，并增强了LC3荧光信号和自噬活性。qPCR和Western blot进一步证实了这些变化。

3.7 Elamipretide通过VEGF依赖性通路恢复老龄卵母细胞质量

Western blot验证了VEGF通路蛋白在老龄卵母细胞中升高、经elamipretide处理后恢复正常。使用VEGF-A转录抑制剂PTC299模拟elamipretide的作用，发现PTC299同样纠正了线粒体异位、减弱了ROS升高、减轻了早期凋亡，并修复了纺锤体组装与染色体排列缺陷。而PI3K抑制剂LY294002和渥曼青霉素未能挽救老龄卵母细胞表型，排除了PI3K/AKT作为下游效应通路的可能性。

3.8 Elamipretide改善人卵母细胞成熟、受精与卵裂

在来自39例患者的临床样本中，elamipretide补充显著提高了高龄妇女（≥35岁）卵母细胞的24小时和48小时成熟率、受精率和卵裂率，对年轻组也显示出一定的促进作用。

3.9 Elamipretide改善氧化应激下猪卵母细胞的成熟

在猪卵母细胞H₂O₂氧化损伤模型中，elamipretide恢复了第一极体排出率，降低了ROS水平，恢复了皮质部线粒体分布，增强了LC3表达，并减轻了凋亡激增，表明其保护作用在跨物种间保守。

讨论与结论

本研究提出一种基于elamipretide的新型多肽疗法用于逆转卵巢衰老。研究发现，elamipretide同步促进老龄卵母细胞的核成熟与胞质成熟，表现为恢复细胞骨架完整性、线粒体功能和细胞器稳态。机制上，elamipretide通过调节维生素B₆代谢进而激活VEGF信号通路发挥作用。代谢组学揭示elamipretide重塑了老龄小鼠卵巢的整体代谢谱，尤其是丙酮酸和维生素B₆代谢途径。转录组学锁定VEGF通路为核心靶点，并通过PTC299抑制实验证实VEGF-A是关键节点。此外，PI3K抑制剂实验排除了经典PI3K/AKT通路的下游参与。综合而言，本研究的结论是：短期elamipretide处理可通过维生素B₆-VEGF轴显著改善老龄雌性小鼠的生育力，其作用机制在于同步拯救卵母细胞的核成熟与胞质成熟缺陷。