《British Journal of Cancer》：Switches in alternatively spliced isoforms impact protein and drug interactions in melanoma, ovarian cancer, and acute myeloid leukemia
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背景：可变剪接（Alternative Splicing）是一种细胞过程，也是蛋白质组多样性的主要来源。主要转录本（Most Dominant Transcript, MDT）的切换，即正常样本与癌症样本之间优势表达异构体发生改变，已被证实可扰乱蛋白质相互作用
背景：可变剪接（Alternative Splicing）是一种细胞过程，也是蛋白质组多样性的主要来源。主要转录本（Most Dominant Transcript, MDT）的切换，即正常样本与癌症样本之间优势表达异构体发生改变，已被证实可扰乱蛋白质相互作用网络并驱动肿瘤进展。因此，识别MDT异构体中的切换事件对于发现诊断性生物标志物或治疗靶点至关重要。
方法：在此，研究人员展示了针对黑色素瘤、卵巢癌和急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）中经验证的MDT切换事件的最全面研究。
结果：研究人员在三种癌症类型中识别出6114个与癌症相关的独特MDT（cancer-associated MDTs, cMDTs），与相应正常组织相比，其中1707个cMDTs编码跨膜蛋白，131个在至少一个癌症队列中以高频率（>30%）出现。研究人员利用基于质谱的蛋白质组学数据验证了12.1%的cMDTs，例如在卵巢癌样本中频繁发现的ADD3长异构体。分析表明，大多数cMDTs丧失与蛋白质伴侣及药物化合物的相互作用，并与剪接体（spliceosome）中的切换事件相关。
结论：本研究识别出可能在黑色素瘤、卵巢癌和AML中作为候选生物标志物的cMDTs，具有改善癌症诊断和支持临床决策的潜力。
论文解读
研究背景与问题
真核生物中，剪接过程负责从pre-mRNA中去除内含子并保留外显子，而可变剪接（Alternative Splicing, AS）则从单一基因座产生多种RNA变体，显著增加蛋白质组复杂性。AS可在组织或器官特异性方式下被调控，并与体温或昼夜节律相关。剪接异构体可具有不同的蛋白质结构或折叠方式，通过重新连接与其他分子（如蛋白质或核酸）的相互作用而影响其功能，且不一定改变其相互作用位点。AS切换事件可由剪接机制基因突变、相关蛋白表达变化或剪接位点区域突变引起。正常与癌变组织间主要转录本（Most Dominant Transcript, MDT）的切换已被证明可驱动肿瘤进展并预测多种癌症的总生存期。例如，SF3B4在卵巢癌中上调，促进DNA损伤修复因子RAD52内含子8的有效剪接，产生功能性RAD52蛋白并促进癌症进展；黑色素瘤中BRAF V600E剪接变体与RAF抑制剂耐药相关；AML中DHX34的替代转录本减少全长DHX34表达，扰乱红系和髓系分化。因此，解析患者剪接谱对于选择合适治疗方案和预测治疗结果至关重要。然而，在蛋白质水平验证剪接异构体表达需要质谱或核糖体谱分析等先进技术，此前缺乏跨多种癌症类型、具有匹配RNA-seq和蛋白质组学数据的大规模系统研究。本研究旨在利用肿瘤剖析（Tumour Profiler, TuPro）项目及TCGA数据，系统鉴定黑色素瘤、卵巢癌和AML中的癌症特异性MDT切换事件，并通过蛋白质组学数据验证其蛋白表达，评估其功能影响。
研究内容与结论
研究人员分析了来自TuPro和TCGA的1117例癌症患者样本（641例原发和117例转移活检），并以GTEx的818例正常皮肤、卵巢和血液样本作为对照。通过整合多组学数据，共鉴定出6114个独特的癌症相关MDTs（cMDTs），来自4151个基因，跨越八个癌症队列。其中1707个cMDTs编码跨膜蛋白，131个在至少一个癌症队列中频率>30%。利用匹配的DIA-MS蛋白质组学数据，研究人员开发了三类证据策略验证cMDTs的蛋白表达：Class I（cMDT特异性肽段）、Class II（非正常MDT肽段）和Class III（差异表达肽段），共验证了12.1%的cMDTs。功能分析显示，大多数cMDTs丧失与蛋白质伴侣和药物化合物的相互作用。该研究识别出一批潜在诊断生物标志物和药物靶点，如卵巢癌中频繁表达的ADD3长异构体、黑色素瘤中的PDCD6短异构体、AML中的USP34长异构体，以及卵巢癌中SLC44A2（CTL2）的异构体切换。此外，研究发现剪接体基因的MDT切换与cMDT数量增加显著相关，且cMDTs常邻近已知癌症相关基因。
主要技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：利用Kallisto对bulk RNA-seq数据进行转录本定量；开发R包MDTToolset识别MDT及切换事件；更新CanIsoNet v2异构体特异性蛋白质相互作用网络（基于STRING v12和3did数据库）；构建IsoDrug异构体-药物相互作用数据库（整合PDBsum、Ensembl和DrugBank数据）；采用DIA-NN处理质谱数据并建立三类肽段证据验证策略；利用PaxDB数据库检查正常样本中cMDT肽段的存在。样本队列来源包括GTEx（正常组织）、TCGA（TCGA-OV、TCGA-SKCM、TCGA-LAML）和TuPro（43例卵巢癌、83例转移性黑色素瘤、28例AML）。
研究结果
三种癌症队列中鉴定出超过5000个MDT切换事件：通过比较癌症与正常组织的MDT谱，共鉴定出6114个cMDTs。转移性上皮性卵巢癌和转移性黑色素瘤的异构体切换事件最多。在TCGA和TuPro队列中共有的cMDTs分别为卵巢癌230个、黑色素瘤301个、AML 71个。高频cMDTs包括卵巢癌中的ADD3长异构体（额外外显子使蛋白更长，与QKI-5下调相关）、黑色素瘤中的PDCD6短异构体（仅含2个EF-hand结构域，可能丧失与DAPk1和VEGFR-2的相互作用）、AML中的USP34最长异构体，以及卵巢癌中SLC44A2的CTL2-P2异构体（具有可检测的胆碱转运活性）。剪接体基因发生MDT切换或同时突变与cMDT数量显著增加相关。
蛋白质组学数据中具有肽段证据的诊断性cMDTs：在样本水平上，检测到214个卵巢癌、271个黑色素瘤和27个AML的Class I cMDTs，以及355、479和27个Class II cMDTs。结合Class III证据，共验证4028个cMDTs（12.1%）。具有肽段证据的cMDTs表现出更高的RNA表达水平。ADD3-202在79.1%的卵巢癌RNA样本和45%的匹配蛋白质组样本中被检测到，其特异性肽段LEENHELFSK在PaxDB正常卵巢样本中未检出。ATP2B4-203在77.5%的匹配蛋白质组样本中被检测到。
大多数具有结构域信息的cMDTs丧失与其他蛋白质和药物化合物的相互作用：在具有结构域相互作用信息的1147个基因编码的1652个cMDTs中，906个丧失与所有相互作用伴侣的结合。TRAPPC5-203在49.5%的TCGA原发黑色素瘤、60.4%的转移性黑色素瘤和66.7%的TuPro样本中表达，该短异构体（121 AA）丧失所有天然相互作用伴侣，且其高表达与较低生存率相关。TP53-209（Δ133p53α）在18个样本中表达，缺乏两个反式激活结构域（TAD1和TAD2）、脯氨酸富集结构域（PRD）及部分DNA结合结构域，无法与MDM2、MDM4、POLR2E和EP300等关键蛋白相互作用。在641个具有药物相互作用信息的cMDTs中，56%丧失与潜在药物靶标的结合能力。PDGFRA-210（154 AA）在TuPro黑色素瘤样本中优势表达，缺乏酪氨酸激酶结构域和四个Ig样结构域，其中酪氨酸激酶结构域是舒尼替尼（Sunitinib）的主要靶点。EPHB4-210在26个TCGA卵巢癌样本中发现，仅保留配体结合结构域，缺乏包括整个酪氨酸激酶结构域在内的所有其他结构域。
讨论与结论
本研究发现转移性上皮性卵巢癌表现出最显著的异构体切换，而AML最少，证实了癌症类型特异性剪接异常差异。通过定制蛋白质组库策略，实现了高达12.1%的cMDTs蛋白水平验证，代表了迄今最高检测水平之一。大多数cMDTs丧失与蛋白质伴侣和潜在药物靶标的相互作用，如TP53-209与MDM2在卵巢癌中的相互作用丧失、PDGFRA-210与舒尼替尼在黑色素瘤中的结合丧失。41%的cMDTs为孤儿事件（仅在单个样本中检测到），可能反映患者特异性剪接改变或技术变异，其中至少26个孤儿cMDTs在蛋白质水平获得证据。本研究识别的cMDTs可作为黑色素瘤、卵巢癌和AML的候选生物标志物，具有改善癌症诊断和支持临床决策的潜力，超过80个异构体特异性肽段可在液体活检中进一步测试用于早期检测或靶向治疗决策。
