基于环境DNA（eDNA）宏条形码与多尺度占有模型的蚊虫监测工作流程开发与验证

《Environmental DNA》：Development and Validation of an Environmental DNA Workflow to Monitor Mosquito Populations

　　

蚊虫是多种病原体的传播媒介，对人类和动物健康构成重大威胁，因此对其监测对于有效控制疾病至关重要。基于环境DNA（eDNA）的方法能够在不进行形态学鉴定的情况下检测其栖息地中的多种生物。然而，该方法需要严格且广泛的方案优化。本研究聚焦于新型监测策略的需求，特别是能够克服传统方法局限性的策略。鉴于水在蚊虫生命周期中的核心作用，研究人员探讨了从水生栖息地收集的eDNA是否能成为蚊虫检测和分类鉴定的有效工具。具体而言，研究人员旨在评估基于eDNA的方法能否在不同群落组成下可靠地检测多种蚊虫物种并准确区分它们。为此，研究人员开发并验证了一种用于蚊虫监测的基于eDNA的检测与鉴定方法的实验流程。首先，研究人员通过对含有五种蚊虫物种幼虫的九种不同组合的样本进行实验室实验，评估了该方法的性能。eDNA占有分析揭示了不同的物种特异性检测概率，其中白纹伊蚊（Aedes albopictus）显示出最高的检出率，而朝鲜伊蚊（Aedes koreicus）最低。在中高幼虫密度（5至50 ind/L）下，总体检测概率较高，而在0.5 ind/L时则下降，表明在极低幼虫浓度下灵敏度降低。随后，研究人员从三种类型的野外地点收集了165份水样，并评估了包括土地利用和位点类型在内的生态变量对蚊虫检测概率的影响。研究结果表明，eDNA代表了一种有前景的蚊虫监测工具，特别是在幼虫密度并非极低的背景下，并可能支持其未来整合到病媒监测与控制项目中。

论文解读

一、研究背景与目的

蚊虫是多种病原体的重要传播媒介，其种群动态的有效监测对于防控蚊媒传染病至关重要。传统的蚊虫监测方法主要依赖于形态学鉴定，通常需借助CDC微型诱蚊灯和CO₂诱捕器捕获成蚊，或通过幼虫勺采法采集幼虫样本。这些方法耗时耗力，且对鉴定人员的专业知识要求较高。近年来，基于环境DNA（eDNA）的分子检测技术为生物多样性监测提供了新的范式。所有生物体都会通过粪便、尿液、毛发、皮肤、蜕皮或释放的细胞及碎片等方式在其环境中留下DNA痕迹。由于蚊虫生活史的一部分在水中完成（产卵、幼虫发育），这使得其eDNA更容易在水体中被富集和检测，因此蚊虫被认为是应用eDNA监测策略的理想候选对象。然而，尽管已有部分研究探索了eDNA宏条形码技术在水体蚊虫监测中的应用，但鲜有研究将重复采样、多物种宏条形码与明确的占有-检测统计模型相结合，以严谨地量化检测概率并处理假阴性（FN）和假阳性（FP）问题。本研究旨在填补这一空白，开发并验证一套结合了实验室控制实验与野外实地采样的eDNA监测工作流程，并利用多尺度占有模型系统评估该方法在不同幼虫密度和不同生态环境下的检测效能。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   实验室控制实验：在意大利米兰大学昆虫饲养室，选取五种蚊虫（白纹伊蚊 Ae. albopictus、朝鲜伊蚊 Ae. koreicus、埃及伊蚊 Ae. aegypti、致倦库蚊 Cx. pipiens、斯氏按蚊 An. stephensi）的L3龄幼虫，配置9种不同物种组合，并在三种总幼虫密度（0.5、5、50 ind/L）下设置实验桶，同时设置阴性对照。
2. 2.
   野外水样采集：在意大利伦巴第大区米兰市及其周边城乡区域，于2022年和2024年两个野外季共采集165份水样，按来源分为三类：诱卵器水（CAT1）、人工容器栖息地（CAT2）和半天然水体（CAT3）。对其中33个位点同步进行了幼虫形态学鉴定作为对比。
3. 3.
   分子生物学方法：使用针对蚊科线粒体16S rRNA基因的特异性引物进行qPCR和宏条形码扩增，在Illumina NovaSeq平台上进行双端测序。
4. 4.
   数据分析与建模：采用OBITools软件包进行序列分析与分类分配。运用Beta回归广义线性模型（GLM）分析影响reads相对丰度的因素。核心创新在于应用了多尺度占有模型（multiscale occupancy model），该模型将过滤膜视为站点重复，将PCR重复视为技术重复，通过最大似然估计（ML）估算占有概率（ψ）、过滤检测概率（θ11）和扩增检测概率（p11）。

三、研究结果

3.1 实验室测试结果

通过分析84张滤膜的宏条形码数据，研究发现不同蚊虫物种的检测效率存在差异。排除最低密度组（0.5 ind/L）后，白纹伊蚊的检测率最高（89%），斯氏按蚊次之（88%），致倦库蚊为82%，而埃及伊蚊（64%）和朝鲜伊蚊（59%）较低。假阳性率（FP）方面，斯氏按蚊最低（3.5%），致倦库蚊最高（14%）。Beta回归模型显示，目标物种的生物量比例与其reads相对丰度呈显著正相关，而过滤体积和其他物种的生物量影响不显著。多尺度占有模型分析表明，排除0.5 ind/L的低密度组后，各物种的占有概率（ψ）估计值显著提升，更接近实际占有情况，表明该方法在中高幼虫密度（5-50 ind/L）下表现可靠。

3.2 野外数据分析

对165份野外滤膜的分析共检测到6种蚊虫：白纹伊蚊、朝鲜伊蚊、致倦库蚊、hortensis库蚊（Cx. hortensis）、annulata环跗脉毛蚊（C. annulata）和cinereus灰色伊蚊（Ae. cinereus）。与33个位点的形态学鉴定结果比较，两种方法在物种丰富度上无统计学显著差异，但形态学略占优势。eDNA和形态学鉴定结果呈现互补性，而非完全一致。GLM分析表明，栖息地类型显著影响检测到的物种数，人工容器栖息地（CAT2）的物种丰富度高于诱卵器水（CAT1）。土地利用类型和距米兰市中心距离对总物种丰富度无显著影响。但在单物种水平上，朝鲜伊蚊、hortensis库蚊和致倦库蚊的存在概率与距城市距离呈正相关，而嗜人血的白纹伊蚊分布较为均匀。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究是首次将多物种宏条形码与占有模型框架结合应用于蚊虫eDNA监测的工作。实验室实验确立了该方法在幼虫密度不低于5 ind/L时的可靠性，低于此阈值（0.5 ind/L）则检测不稳定。物种间检测概率的差异可能源于eDNA脱落率的种间差异（如羽化过程会增加DNA释放）或潜在的引物偏好性。假阳性率虽略高于理想范围，但可能由近距离桶间的气溶胶交叉污染或高循环数PCR带来的随机扩增噪声导致。野外实验证实了eDNA作为一种补充工具的价值，它能够提供与传统形态学鉴定互补的信息，尤其在评估栖息地类型和城市化梯度对蚊虫分布影响方面展现出潜力。

研究结论认为，本研究为标准化蚊虫eDNA监测奠定了基础，所开发的实验流程可支持病媒管理，并为公共卫生策略应对虫媒疾病做出贡献。尽管仍存在知识空白，但研究再次证明eDNA方法在生物多样性监测中的优势。未来研究应致力于提高对低DNA脱落率物种的检测灵敏度和特异性，并将eDNA与传统采样方法及遥感等技术整合，以构建更全面的蚊虫种群监测体系。