雌激素受体β（ERβ）亚型互作整合核内与核外信号调控人颗粒细胞（hGC）生长与功能

《The FASEB Journal》：Estrogen Receptor Beta Isoforms Interplay Integrates Nuclear and Extra-Nuclear Signaling to Modulate Human Granulosa Cell Growth

雌二醇（E₂）主要通过雌激素受体β（ERβ）调控卵巢卵泡发育和颗粒细胞（GC）功能。人GC表达若干ERβ亚型，包括ERβ₁、ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅，但其相对丰度如何调节雌激素信号仍不清楚。在此，研究人员研究了核内和核外ERβ信号对人GC生长和功能的贡献。将缺乏内源性雌激素受体的HGrC1颗粒细胞经工程化改造以稳定表达单个或组合ERβ亚型。功能分析显示，ERβ₁和ERβ₄抑制GC增殖，而ERβ₂和ERβ₅促进细胞生长。所有亚型共表达导致总体抑制作用，表明GC反应取决于ERβ亚型平衡而非单一受体。报告基因实验表明，仅ERβ₁激活雌激素反应元件（estrogen response element, ERE）依赖性转录，而其他亚型抑制E₂依赖性ERα反式激活。相反，ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅以不依赖配体方式激活AP-1（activator protein-1）信号并减弱ERβ₁介导的抑制，从而确定AP-1是ERβ亚型互作的中心节点。在原代人颗粒黄体细胞中选择性耗竭ERβ₁后的RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）显示，ERβ₁是E₂反应性所必需的，并调控参与膜电位、离子转运和细胞骨架组织的基因。蛋白质组学和生化分析进一步鉴定出涉及细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）、蛋白激酶B（Akt）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMKII）通路的亚型特异性信号网络。总之，这些发现表明，ERβ亚型平衡通过协调的核内和核外机制调控雌激素信号，从而控制GC生长和功能。

雌二醇（E₂，卵巢主要雌激素）是广泛生理功能的关键调节因子。E₂经雌激素受体α（ERα）促进细胞增殖，而ERβ激活可刺激增殖或诱导凋亡，取决于ERα是否存在。人特异性ERβ亚型包括ERβ₁、ERβ₂、ERβ₃、ERβ₄和ERβ₅；除ERβ₃为睾丸特异外，其余在E₂反应组织中差异表达且至少两种可共存。ERβ亚型因第8外显子可变剪接导致C端不同，除ERβ₁外均丧失E₂结合能力。ERβ₁对应经典ERβ功能，即抗增殖和促凋亡；ERβ₂和ERβ₅在多种癌症中异常表达并与临床结局相关。人卵巢中已检测到ERβ₁及ERβ₂、ERβ₄、ERβ₅ mRNA，成熟人颗粒细胞（granulosa cell, GC）共表达低水平ERα和高水平ERβ亚型mRNA，但各ERβ亚型对GC功能的生物学贡献仍未知。因此，研究人员旨在解析核内与核外ERβ信号对人GC生长和功能的贡献，并检验ERβ亚型平衡的作用。

研究人员在缺乏内源性雌激素受体的HGrC1人GC系中稳定表达单个或组合ERβ亚型，并结合功能、转录组和蛋白质组分析。结果显示，ERβ₁和ERβ₄抑制GC生长，ERβ₂和ERβ₅促进生长；四种亚型共表达时总体呈抑制作用。只有ERβ₁激活ERE依赖性转录，其他亚型可抑制E₂依赖性ERα反式激活；ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅以非配体方式激活AP-1并减弱ERβ₁介导的抑制。原代hGC中ERβ₁是E₂反应所必需，并调控膜电位、离子转运和细胞骨架组织相关基因。亚型特异性信号网络涉及ERK1/2、Akt和CaMKII；互作组分析显示不同亚型具有共享和特异的蛋白互作网络。该研究提示，ERβ亚型平衡通过协调核内和核外机制决定雌激素信号结局，对理解卵巢内分泌生理和疾病具有重要意义。

关键技术方法概述：样本来自法国Clamart的Antoine Béclère Hospital接受体外受精（in vitro fertilization, IVF）的5名因输卵管或男性因素不孕的女性。关键技术包括：在缺乏内源ER的HGrC1细胞中稳定表达单个或组合ERβ亚型；MTT法检测生长，BrdU掺入免疫荧光检测增殖；ERE和AP-1荧光素酶报告基因检测转录活性；shRNA敲低ERβ₁后对原代hGC进行RNA-seq；Western blot检测ERK1/2、Akt和CaMKII磷酸化；Flag标签免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）结合液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）分析互作组。

研究结果：
3.1 ERβ亚型的组合作用调控GC生长。通过HGrC1稳表达细胞和MTT实验，ERβ₁或ERβ₄显著降低细胞生长，ERβ₂在96 h促进生长，ERβ₅自72 h起促进生长；共表达四种亚型的4β细胞生长降低。RT-qPCR显示，ERβ₂和ERβ₅上调EGR1、MYC，ERβ₅上调CTNNB1；ERβ₁和ERβ₄下调CTNNB1，ERβ₁下调MYC；4β细胞中EGR1和MYC降低，BAX/BCL2比值不变。结论是单个亚型的促生长效应可被共表达时抑制性亚型主导。

3.2 ERβ亚型在HGrC1细胞中的转录活性特征。通过ERE或AP-1驱动的荧光素酶报告基因实验，并模拟GC中ERβ:ERα比例。
3.2.1 ERβ亚型抑制E₂依赖ERα在ERE位点反式激活。仅ERβ₁表现出显著配体依赖性和较低的非配体依赖性ERE反式激活；ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅无显著ERE反式激活，也不干扰ERβ₁反式激活。所有ERβ亚型均显著降低E₂依赖性ERα反式激活，但不影响非配体ERα活性。
3.2.2 ERβ₂、ERβ₄或ERβ₅阻止非配体依赖ERβ₁对AP-1报告活性的反式抑制。ERβ₁在E₂存在时抑制AP-1报告活性，而ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅以非配体方式激活AP-1报告活性；这些亚型可抵消ERβ₁的基础反式抑制。共表达所有ERβ亚型时基础AP-1驱动转录略增，E₂下仍呈抑制；ERα在HGrC1细胞中对AP-1调控作用有限。

3.3 鉴定介导ERβ亚型活性的不同核内和核外信号机制。
3.3.1 在hGC中表征新的ERβ₁转录特征。对5例原代hGC以shRNA选择性敲低ERβ₁后行RNA-seq，发现ERβ₁敲低后E₂不能诱导显著差异表达基因，说明ERβ₁是E₂转录反应所需。S_E2与S_CT比较鉴定出76个差异表达基因；ERβ₁依赖基因富集于离子通道活性、膜电位调节和运动活动。CACNA1A、GRIK4和ANO2在ERβ₁表达的HGrC1细胞中显著上调。
3.3.2 ERβ₁、ERβ₂和ERβ₄而非ERβ₅激活HGrC1不同核外信号通路。Western blot显示，ERβ₁和ERβ₄增加ERK1/2磷酸化，ERβ₂和ERβ₄增加Akt磷酸化，ERβ₁和ERβ₂增加CaMKII磷酸化；共表达四种亚型时这些通路未被显著激活。
3.3.3 ERβ亚型在HGrC1中具有不同互作组。Flag标签IP结合LC–MS/MS鉴定出138个高置信度互作蛋白；ERβ₁在vehicle条件下与HSP90A互作，E₂后与核蛋白、膜运输、微管相关蛋白及GPC1互作。四种亚型共享17个互作子，其中10个为潜在新互作子；ERβ₁、ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅分别有61、6、8和37个特异互作子。HSP90A仅与ERβ₁互作。结论是ERβ亚型可作为支架样蛋白整合不同核内和核外信号。

讨论部分总结：4.1 ERβ亚型间功能互作控制GC生长和信号。ERβ₁和ERβ₄抗增殖，ERβ₂和ERβ₅促增殖；共表达时抗增殖特征占优势，提示异二聚化、受体构象改变或竞争共享信号中间体可能限制信号输出。4.2 AP-1依赖和非配体转录是ERβ亚型基因组作用的主要模式。ERβ₂、ERβ₄和ERβ₅不能激活ERE，但增加AP-1报告活性并减弱ERβ₁抑制，具有细胞类型特异性，可能在低E₂条件下尤为重要。4.3 hGC中E₂依赖性转录调控由ERβ₁介导。ERβ₁上调离子转运和离子通道相关基因，包括CACNA1A、ANO2和GRIK4，并与ARHGAP21、TBCE等互作，涉及cAMP及离子信号通路。4.4 亚型特异互作组揭示不同信号模式。各亚型与核转录辅因子、膜运输、线粒体代谢和细胞骨架相关蛋白互作，提示其不仅作为转录因子，还可能作为信号整合支架调控GC功能。

研究结论部分翻译：总体而言，本研究强调ERβ亚型平衡在决定雌激素信号结局中的潜在意义，并为GC中ERβ信号提供新见解。多种ERβ亚型在雌激素反应组织中的频繁共表达，凸显了解析亚型特异性信号机制和亚型互作的重要性。现在有必要更精确地表征GC中ERβ亚型的时间和空间表达；然而，这需要开发可靠的亚型特异性抗体，而这类抗体目前仍不可获得。最终，更深入地理解ERβ亚型互作对于更好地阐明内分泌生理和疾病中的雌激素作用至关重要。