《HUMAN MUTATION》：Integrated Approach to Diagnosing Limb-Girdle Muscular Dystrophies in Resource-Limited Settings
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肢带型肌营养不良（LGMD）是一组遗传异质性神经肌肉疾病，其特征为临床特征重叠，包括进行性肌无力和肌萎缩、肌酸激酶（CK）水平升高以及运动和骨骼异常。由于表型重叠和严重程度可变，仅依靠临床诊断往往不可靠。纳入遗传学检查以辅助诊断/鉴别诊断已加速诊断进程，但很大
肢带型肌营养不良（LGMD）是一组遗传异质性神经肌肉疾病，其特征为临床特征重叠，包括进行性肌无力和肌萎缩、肌酸激酶（CK）水平升高以及运动和骨骼异常。由于表型重叠和严重程度可变，仅依靠临床诊断往往不可靠。纳入遗传学检查以辅助诊断/鉴别诊断已加速诊断进程，但很大程度上仍局限于发达国家。在此，研究人员在资源有限环境中将遗传检测作为一线方法以简化诊断路径，并结合初步功能分析以鉴定潜在遗传学病因。研究队列包括来自29个家系的46例受累个体（31例男性，15例女性），平均年龄为23.59 ± 11.87岁，平均发病年龄为14.8 ± 9.2岁。所有个体均表现为进行性肌无力、CK水平升高、运动困难和步态异常。遗传检测在CAPN3（8个家系）、DYSF（15个家系）、LAMA2（4个家系）和SGCA（1个家系）中鉴定出致病/可能致病变异，而在COL12A1（1个家系）中鉴定出意义未明变异（VUS）。对患者来源成纤维细胞的初步功能研究显示，家系1中鉴定的COL12A1: p.(Val1051Leu)导致mRNA和蛋白丰度降低。总体上，共鉴定出25个独特变异，包括17个新变异。该研究强调，整合遗传与功能方法有助于在低中收入环境中促进准确诊断。
肢带型肌营养不良（LGMD）由1954年Walton和Nattrass提出，用于描述一组主要累及近端肢带的进行性肌无力和肌萎缩疾病。其估计患病率在1/14,500至1/123,000之间。LGMD由编码肌肉纤维结构、功能和维持成分的基因缺陷引起，这些成分定位于不同细胞区域，包括细胞核、肌节、肌膜和细胞外基质。根据致病变异的功能影响，该组疾病以常染色体显性（1型LGMD或LGMDD）或常染色体隐性（2型LGMD或LGMDR）方式遗传，其中隐性形式更常见且通常更严重。迄今已报道30多种LGMD类型，具有不同遗传决定因素、可变疾病严重程度和重叠临床特征。疾病严重程度取决于发病时间，常从近端肌肉开始，对称性进展并累及所有肌肉类型，还可能导致心肌病或呼吸衰竭等其他器官异常。LGMD2A/LGMDR1是最常见亚组，占所有LGMD病例的40%–50%，由CAPN3（calpain-3）功能障碍引起。LGMD2B/LGMDR2由DYSF（dysferlin）缺陷引起。除CAPN3和DYSF外，其余LGMD类别多由结构蛋白功能障碍引起。肌聚糖相关LGMD是第二常见类型，由形成肌营养不良蛋白相关蛋白复合物（DAPC）以维持肌纤维完整性的蛋白引起。这些疾病常与CK水平升高相关。无论具体亚型和发生率如何，其对医疗系统和家庭负担巨大，部分原因是表型重叠、严重程度可变、遗传异质性以及缺乏治愈手段，这些共同导致诊断复杂、靶向干预延迟和长期护理需求增加。在巴基斯坦等低中收入国家（LMICs），高近亲婚配率、有限基础设施和专业知识使相当比例患者缺乏明确诊断。
仅基于临床特征的诊断常易出错，因为由基因型驱动的表型结果可受环境、年龄和遗传背景等因素微妙影响。对于LGMD这类基因-疾病关系已较明确的疾病，纳入遗传学检查以辅助诊断/鉴别诊断已加速诊断过程，并有助于遗传咨询和及时姑息治疗。为此，研究人员采用综合方法研究29个家系中46例具有LGMD特征的患者，开展外显子组测序（ES）、通过Sanger测序进行分离分析，并在家系1中开展功能分析，以鉴定这些家系的潜在遗传学病因。
研究方法概括如下：研究经Aga Khan University伦理审查批准，家系通过巴基斯坦不同地区社区采样以及Aga Khan University Hospital, Karachi神经内科和临床遗传门诊招募。队列包括29个家系、46例受累个体，所有家系彼此无关。临床遗传检测由商业实验室完成，社区采样家系在内部处理；采用ES和基因panel检测，使用Sanger测序对候选变异进行分离验证，按美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南进行变异分类。对COL12A1变异进行多物种氨基酸保守性分析。功能研究使用患者来源皮肤成纤维细胞，采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、免疫细胞化学和免疫印迹，相对表达采用2
?ΔΔCt法，蛋白印迹条带强度以ImageJ定量。
3.1 在未解决肌营养不良家系中鉴定LGMD相关基因的双等位变异。研究人员通过整合遗传、临床和实验研究调查29个肌营养不良家系，共46例受累个体，平均年龄23.59 ± 11.87岁，平均发病年龄14.8 ± 9.2岁。8个多受累个体家系通过社区采样获得，其余21个家系仅先证者来自Aga Khan University Hospital, Karachi神经内科和临床遗传门诊。临床上，45例CK升高，近全数高CK血症；下肢无力、髋带无力、运动困难、步态异常、站立困难、上肢无力和肩带无力常见。遗传检测在28个家系（44例）中获得诊断发现：CAPN3致病/可能致病变异8个家系（14例），DYSF 15个家系（20例），LAMA2 4个家系（6例），SGCA 1个家系（4例）；COL12A1意义未明变异1个家系（2例）。共发现25个独特变异，涉及CAPN3（6个）、DYSF（13个）、LAMA2（4个）、SGCA（1个）和COL12A1（1个）；8个（30.8%）已发表，17个（69.2%）未发表。按变异类别，移码变异最常见（9个），其次为剪接位点变异（7个）、错义变异（6个）和无义变异（3个）。这些发现表明该队列中存在较高比例未报道变异，尤其是截短和剪接位点改变。
3.2 COL12A1双等位错义变异导致家系1 Ullrich先天性肌营养不良2。家系1来自巴基斯坦Khyber Pakhtunkhwa省农村地区，两名男性患者（IV:2和IV:4）分别为11岁和7岁。两人均表现明显先天性肌张力低下、进行性全身运动功能障碍、累及肩带和骨盆带的近端肌无力、远端关节过度松弛、下肢挛缩和躯干不稳；面部和骨骼特征包括肿胀松软面容、后凸、高腭弓、皮肤过度伸展苍白和轻度蓝色巩膜，认知功能正常，仅血清CK升高。ES发现COL12A1（NM_004370.6）新型纯合错义变异c.3151G>C, p.(Val1051Leu)，Sanger测序验证并按隐性模式分离。该变异按ACMG分类为VUS。保守性分析显示Val1051及周围氨基酸区域在多物种中高度保守。患者来源成纤维细胞qRT-PCR显示COL12A1 mRNA水平较对照降低超过50%；免疫细胞化学显示患者细胞内COL12A1蛋白表达减少；免疫印迹通过平均灰度值估算显示患者细胞COL12A1水平降低超过80%，而COL6A2水平未改变。研究人员认为该变异影响mRNA和蛋白丰度，是该家系疾病最可能原因；但这些实验基于单一患者来源细胞系且为各检测的单次代表性实验，结果应谨慎解释。
3.3 八个家系携带CAPN3变异导致肢带型肌营养不良隐性1。家系2来自Punjab省Rawalpindi地区，两名患者II:2和II:3于学龄期出现发育倒退、反复跌倒和进行性肌无力，最终丧失行走能力，并伴双侧肢体挛缩；II:3还有癫痫史。家系3患者表现为近端和远端肌肉均受累的进行性肌营养不良，成年早期严重肌无力。家系4为扩展近亲家系，三个患者表现为青少年起病、进行性对称性近端肢带无力，部分伴视觉损害或眼动异常。ES在家族2、3、4患者中鉴定出CAPN3（NM_000070.3）致病纯合变异c.1469delinsTC, p.(Arg490LeufsTer87)，按隐性模式分离。家系6先证者20岁女性，9岁起肌无力，13岁上下楼困难，17岁上肢无力，ES发现CAPN3纯合致病变异c.257del, p.(Ser86PhefsTer)。家系8的15岁男性先证者表现为近端肌无力、步态异常和显著CK升高，并伴严重高甘油三酯血症，靶向panel发现已报道的CAPN3纯合剪接区致病变异c.379+3A>G, p.(?)。两个兄弟有相似疾病但无生物材料行遗传检测。家系5、7、9的CAPN3变异临床和遗传发现已总结。总体上，这些发现与隐性钙蛋白酶病表现一致，并扩展了LGMD2A/LGMDR1突变谱和部分表型边界。
3.4 DYSF破坏性双等位变异导致15个无关家系肢带型肌营养不良隐性2。家系10来自Rawalpindi，三名女性患者于16–18岁起病，先有髋伸肌无力和需支持行走，后缓慢进展，ES发现DYSF（NM_003494.4）剪接供体位点变异c.342+1G>A, p.(?)，与疾病状态分离。家系11来自Punjab南部，四个患者表现为进行性肌无力、步态异常和行走能力丧失，遗传分析发现DYSF剪接位点变异c.2163-1G>T, p.(?)，按ACMG为致病变异，Sanger验证并按隐性模式分离。家系12先证者25岁起病，ES发现未发表的可能致病DYSF变异c.4440del, p.(Lys1480AsnfsTer6)。家系17患者伴劳力性呼吸困难、关节不适、光敏感和肌肉压痛，panel发现DYSF双等位致病剪接供体变异c.457+1G>A。家系19患者表现为进行性近端肌无力、摇摆步态、吞咽困难和胸骨后疼痛，panel发现DYSF纯合无义变异c.1471G>T, p.(Glu491Ter)。家系20患者表现自下肢向上肢阶梯式进展的无力、脊柱姿势改变和显著CK升高，靶向测序发现DYSF纯合缺失c.2846_2852del, p.(Phe949_Val950delinsTer)。家系13–16、18、21–24的发现已总结。总体支持DYSF相关LGMDR2，并扩展DYSF突变谱。
3.5 LAMA2功能丧失变异导致四个家系肌营养不良。家系25三名患者为近亲父母所生，6月龄起病，表现严重肌无力、先天性肌张力低下、不能行走、脊柱侧后凸和四肢关节挛缩，完全卧床。遗传检测发现LAMA2（NM_000426.4）未发表变异c.8596delA, p.(Ala2866LeufsTer37)。家系26先证者为成年起病肢带型表现，进行性近端肌无力、摇摆步态、肌肉僵硬和CK升高，panel发现LAMA2纯合移码变异c.8903del, p.(Phe2968SerfsTer25)，符合laminin-α2相关肌营养不良。家系27患者最早起病，产前和新生儿期即异常，表现为肢带无力、肌张力低下、运动里程碑延迟和持续不能行走，ES发现LAMA2纯合剪接位点变异c.3411+1G>T, p.(?)，确认先天性起病laminin-α2相关肌营养不良。家系28发现已总结。总体上，家系25、27和28符合严重早发MDC1A，家系26更符合晚发LGMDR23。
3.6 SGCA双等位变异导致家系29常染色体隐性肢带型肌营养不良3。家系29来自Sindh省内陆，四名男性患者来自两个相关分支。患者均足月自然分娩，表现进行性神经肌肉表型，包括发育里程碑延迟、肌萎缩、周围神经病特征、共济失调步态和独立行走能力丧失。ES发现SGCA（NM_000023.4）两碱基缺失c.162_163delCC, p.(Pro55ThrfsTer49)，预测导致移码和提前终止密码子，可能触发无义介导降解。按ACMG分类为致病变异，并与疾病状态分离。四名患者表现与LGMDR3表型一致。
讨论部分总结：该研究报告29个家系中46例具有重叠肌营养不良临床特征且家族史提示遗传病因的患者。传统LGMD诊断通常需要肌肉活检和组织学分析以补充临床数据，这在LMICs中给患者和医疗系统带来负担，且仍常无法获得明确分子诊断。为简化流程、避免误诊和缩短诊断等待时间，研究人员采用遗传与功能研究相结合的综合方法。与文献一致，CAPN3和DYSF变异最常见，其次为SGCA破坏性变异；29个家系中28个获得诊断发现，1个家系携带COL12A1的VUS。研究人员认为综合诊断方法高效，并建议在LMICs中将遗传检查作为协同组成部分。家系1的COL12A1变异导致UCMD2和BTHLM2相关表型；患者临床与UCMD2重叠，但未观察到呼吸受累和喂养困难，可能与错义变异功能影响较轻有关。该错义变异与患者来源成纤维细胞转录本丰度降低相关，提示可能影响转录稳定性或加工，但机制未确立。CAPN3致病变异见于8个家系，临床与LGMDR1一致，但家系2-II:3癫痫和家系7早发 atypical，家系3和4早期严重远端受累扩展了表型边界。研究人员观察到可能的奠基者效应：CAPN3 c.1469delinsTC在3个无关家系中出现，CAPN3 c.379+3A>G在另外2个家系中出现，DYSF c.5341-2A>C在3个独立家系中出现，提示共享祖先来源，并与巴基斯坦人群近亲婚配和内婚实践相关。DYSF变异见于15个家系，包含5个剪接位点、4个移码、2个错义和2个无义独特变异，其中8个首次报道；临床更支持LGMDR2而非MMD1。LAMA2功能丧失导致MDC1A至LGMDR23谱系表现。SGCA双等位移码变异导致LGMDR3。
研究结论翻译：总之，研究人员诊断了29个家系、共46例LGMD受累个体，突出了显著的临床和遗传异质性。研究人员在COL12A1、CAPN3、DYSF、LAMA2和SGCA中鉴定出17个未报道变异，扩展了这些基因的突变谱。研究结果支持将遗传检测纳入一线诊断方法，尤其是在低中收入国家（LMICs）环境中，这可提高诊断准确性、缩短诊断历程并减少对侵入性和资源密集型操作的依赖。此外，基于社区的招募用于遗传诊断似乎对大家系携带者筛查和减轻有限医疗资源负担更高效。此外，研究结果强调亟需提高公众对近亲婚配影响的认识。
