基于响应面法优化黑种草籽油脱色工艺：三种吸附剂协同作用的多目标研究

《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：A Response Surface Methodology Approach to Optimizing the Bleaching Process of Black Seed (Nigella sativa L.) Oil

　　

摘要专业翻译 黑种草籽油（Black seed oil，BS油）因其药用潜力和促进健康的特性而成为一种极具价值的功能性油脂。然而，毛油中含有不良色素和氧化产物，应通过脱色等精炼工艺予以去除，但此类工艺也可能影响生物活性成分。尽管脱色土（bleaching earth）是这方面研究最为广泛的吸附剂，但脱色土、活性炭（activated carbon）和硅胶（silica gel）对BS油品质的联合效应及交互效应尚未得到系统评估。本研究采用响应面法（response surface methodology，RSM）结合D-最优设计（D-optimal design），评估并优化了这三种吸附剂（各0%–5% w/w）对黑种草籽油品质特性的联合影响，考察指标包括过氧化值（peroxide value，PV）、茴香胺值（anisidine value，AV）、红色和黄色色度指数、叶绿素（chlorophyll）、类胡萝卜素（carotenoid）及百里醌（thymoquinone）含量。活性炭对颜色降低的效应最强，而脱色土在去除叶绿素方面更为有效。大多数模型具有统计学显著性（p < 0.05），但部分响应出现了显著的失拟（lack of fit）和负的预测R2值（Pred R-squared），表明在研究区域之外预测能力有限。采用期望函数法（desirability function approach）对敏感性模型（排除毛油对照试验，见表S1–S3）进行数值优化，确定了最优条件为5%脱色土、5%活性炭和3.85%硅胶，整体期望值（desirability）为0.806。这些条件有效降低了氧化指标和色素含量，同时保留了中等水平的百里醌。除所确定的具体最优条件外，本研究还证明，将化学性质不同的吸附剂组合使用（而非工业实践中常见的单独依赖脱色土），提供了一种实用且可调谐的策略，可在色素去除与生物活性成分保留之间取得平衡，对BS油及其他特种籽油的工业规模加工具有直接参考意义。

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一、研究背景与问题

黑种草籽油（BS油）因其富含百里醌（thymoquinone）、生育酚（tocopherols）、植物甾醇（phytosterols）和酚类化合物等生物活性成分而备受关注，具有抗炎、抗菌及预防糖尿病、高血压和氧化应激相关疾病的潜在功效。然而，毛油中往往含有游离脂肪酸、磷脂和色素等杂质，这些杂质会严重影响油脂的稳定性、感官品质和货架期。其中，叶绿素（chlorophyll）等色素在光照条件下可作为光敏剂加速脂质氧化，导致油脂酸败、产生异味并造成营养劣变。此外，氢过氧化物（hydroperoxides）和次级挥发性化合物等氧化产物也会降低油脂的抗氧化活性，甚至形成有害物质。

脱色是油脂精炼中去除这些杂质的关键步骤。传统上，脱色土（bleaching earth）、活性炭（activated carbon）和硅胶（silica gel）是常用的脱色吸附剂。脱色土通常是酸活化的膨润土或蒙脱石黏土，主要依靠物理吸附和离子交换机制选择性吸附色素、微量金属和氧化产物；活性炭凭借发达的微孔结构和巨大的比表面积，通过范德华力和化学吸附高效去除极性杂质和有机色素；硅胶则通过氢键和静电相互作用选择性吸附磷脂和皂类物质。然而，这些吸附剂单独使用时均存在局限，包括过滤过程中的油脂损失、生物活性成分的降解以及废弃吸附剂处置带来的环境问题。

此前关于BS油精炼的研究，如Abedinzadeh等人的工作，虽然考察了精炼对BS油品质的影响，但脱色步骤均采用固定浓度（1%）的脱色土，未系统考虑不同吸附剂浓度及其交互作用。因此，现有研究存在明显的知识空白：缺乏对BS油脱色工艺最优条件的系统研究，尤其是多种吸附剂在不同浓度组合下的个体效应和交互效应尚未被评估。此外，传统的试错法（hit-and-trial approach）在确定加工最优条件方面效率低下，需要借助响应面法（RSM）和实验设计（DOE）技术来实现这一目标。

二、研究目的与意义

本研究旨在通过RSM最大化BS油的脱色效率，考察脱色土、活性炭和硅胶在0%–5%（w/w）浓度范围内对BS油品质的个体效应和交互效应，以颜色、茴香胺值（AV）、过氧化值（PV）以及叶绿素和类胡萝卜素含量作为最重要的品质响应指标进行评价。与以往将脱色作为整体精炼过程一部分的研究不同，本研究将脱色工艺作为独立阶段进行优化，并首次系统评估三种化学性质不同的吸附剂的协同作用，为工业规模BS油及其他特种籽油加工提供实用策略。

三、关键技术方法

研究人员采用RSM结合D-最优设计（D-optimal design）进行实验设计，共16个试验组，通过Design-Expert软件（Version 10）生成。D-最优设计相较于中心复合设计（central composite design）和Box–Behnken设计，无需对称的星点或中心点结构，更适合三因素七响应的建模需求。脱色工艺在110°C下搅拌90分钟，使用Whatman No 5滤纸过滤。关键检测方法包括：PV按AOCS官方方法Cd 8b-90测定；AV按AOCS官方方法Cd 18-90测定；颜色采用紫外-可见分光光度法测定；叶绿素和类胡萝卜素含量按Minguez-Mosquera等方法，在670 nm和470 nm波长下测定吸光度并计算；百里醌含量采用HPLC法（Agilent 1260系统，Zorbax XDB-C8色谱柱）按Alkhatib等验证的方法测定。所有测定均重复三次。

四、研究结果

4.1 模型拟合与统计分析

研究人员根据序贯模型平方和、失拟检验以及调整R2和预测R2的比较，为各响应选择了不同阶次的模型：PV采用二次模型（quadratic model），AV和叶绿素含量采用双因素交互模型（2FI model），红色、黄色、类胡萝卜素和百里醌含量采用线性模型。R2值范围为0.4158（百里醌）至0.9709（PV）。多数模型的调整R2与R2吻合良好，表明模型未过度拟合。但部分响应出现负的预测R2值，且所有响应的失拟检验均显著（p < 0.05），表明模型在实验区域外的预测能力有限。研究人员通过排除毛油对照试验（Run 1和Run 10）进行敏感性分析，发现排除后五个响应的预测R2得到改善，说明负的预测R2主要源于设计点数量相对估计的高阶项数量不足，而非对照试验本身所致。

4.2 吸附机制与组合吸附剂的理论依据

三种吸附剂的表面化学性质截然不同，因此选择性吸附的杂质类别也不同。脱色土通过物理吸附（伦敦色散力、偶极-偶极、氢键）和化学吸附（类胡萝卜素与酸活化产生的Br?nsted和Lewis酸位点结合）发挥作用；活性炭依靠发达的微孔和比表面积去除极性和多环芳烃类化合物；硅胶通过表面硅醇基团与磷脂、皂类等极性物质发生氢键和静电相互作用。由于各吸附剂针对不同类别的杂质，其混合效应不应完全可加：当吸附剂竞争结构相似的位点时（如脱色土和活性炭作用于色素分子），混合效应低于单独效应之和；当针对不同类别的杂质时，混合可能优于单一吸附剂。这与向日葵油研究中活性炭少量添加即可提升混合吸附剂去除色素和多环芳烃性能的协同效应一致。

4.3 过氧化值（PV）

未经处理的毛油PV为24.93 meq O?/kg油，经脱色处理后所有试验组的PV显著下降，范围为0.93–11.54 meq O?/kg油。最低PV出现在Run 14（5%脱色土、5%活性炭、无硅胶），为0.93 meq O?/kg油。二次模型具有统计学显著性（p < 0.001），R2 = 0.9709。脱色土（A）和活性炭（B）对PV有显著影响（p < 0.001），硅胶（C）无显著影响，交互项AB和二次项A2显著。回归系数中A和B为负值，表明增加脱色土和活性炭浓度可降低PV。响应面图显示脱色土和活性炭之间存在强协同效应，两者同时增加时PV急剧下降。活性炭因高孔隙率和极性性质对PV的影响最大，脱色土通过吸附-离子交换机制发挥作用，硅胶单独使用时对PV影响较弱。

4.4 茴香胺值（AV）

毛油AV为0.768，脱色后AV范围为1.10–4.38，未呈现明确趋势。最高AV出现在Run 6（5%脱色土、0%活性炭、5%硅胶），为4.38；最低AV出现在Run 10（无脱色土和活性炭），为1.10。2FI模型具有统计学显著性（p = 0.0242），但R2 = 0.7444、调整R2 = 0.5740、预测R2 = ?0.1846，预测能力较差。仅脱色土（A）对AV有显著影响（p < 0.05），且系数为正，表明增加脱色土会增加次级氧化产物。活性炭和硅胶系数为负但不显著。这一现象可解释为酸活化脱色土可催化氢过氧化物分解为次级羰基化合物，从而暂时提高AV；而活性炭因高比表面积和极性可有效吸附醛类等次级氧化产物。硅胶对AV影响微弱，因其主要功能是去除磷脂而非氧化产物。

4.5 颜色测量

毛油红色值为9.6、黄色值为70，脱色后红色范围为1.2–3.5，黄色范围为21–70。最低颜色值出现在高吸附剂含量且脱色土与活性炭组合的试验组。红色线性模型显著（p < 0.05），R2 = 0.5883，仅活性炭（B）显著（p < 0.05），系数为负。黄色线性模型高度显著（p < 0.01），R2 = 0.8752，活性炭（B）为最显著因素（p < 0.001），系数为负，脱色土接近显著（p ≈ 0.06），硅胶无影响。两种颜色响应均选用线性模型，说明吸附剂间无统计学交互作用，脱色土与活性炭组合的协同效果源于两者的加性效应。活性炭在降低红、黄色度方面表现最优，脱色土次之，硅胶对色素去除贡献甚微。

4.6 叶绿素和类胡萝卜素含量

毛油叶绿素含量为4.22 mg/kg，脱色后最低降至0.001 mg/kg（Run 14）。2FI模型显著（p < 0.05），R2 = 0.7496。脱色土（A）显著（p < 0.05），活性炭（B）接近显著（p ≈ 0.06），两者系数均为负。脱色土因高比表面积和离子交换能力对叶绿素去除效率最高，活性炭因孔隙率和极性亲和力也有效，硅胶对色素去除效果差。类胡萝卜素含量从毛油的21.44 mg/kg降至最低4.05 mg/kg（Run 2）。线性模型显著（p < 0.05），R2 = 0.4979，但无单个因素显著。三种吸附剂均降低类胡萝卜素含量，活性炭系数最大。类胡萝卜素去除不如叶绿素彻底，因其极性较低、在甘油三酯基质中溶解度更高。这一差异与分子结构有关：叶绿素的高极性使其对吸附剂亲和力更强。

4.7 百里醌含量

毛油百里醌含量为2984 mg/kg油，脱色后降至45–1552 mg/kg油。最低值出现在Run 4（0%脱色土、5%活性炭、5%硅胶），为45 mg/kg油。线性模型不显著（p > 0.05），R2 = 0.4158，无单个因素显著。回归系数显示三种吸附剂均降低百里醌含量，活性炭系数最大，是主导吸附剂。百里醌的降低归因于其部分吸附于吸附剂表面（尤其是活性炭的多孔结构和对有机物的强亲和力），以及脱色过程中的热分解和氧化反应。这揭示了脱色工艺中的关键权衡：虽然大幅改善了油脂的氧化稳定性、颜色和色素品质，但显著降低了产品的营养特性。

五、优化与验证

研究人员采用期望函数法进行数值优化，以最小化氧化指标（PV、AV）、颜色指标（红色、黄色）和色素含量（叶绿素、类胡萝卜素），同时最大化百里醌保留。由于毛油对照试验不属于实际脱色配方空间，优化基于排除这两个点的14-run敏感性模型进行。在软件生成的81个解决方案中，最高期望值（D = 0.806）出现在5.00%脱色土、5.00%活性炭和3.85%硅胶的组合。预测响应值包括PV为1.33 meq O?/kg、AV为2.05、红色为1.11、黄色为17.32、叶绿素为0.0025 mg/kg、类胡萝卜素为4.05 mg/kg、百里醌为489.0 mg/kg。脱色土和活性炭均达到实验区域上限（5% w/w），表明这两种因素的实际最优可能位于或超过5%；硅胶则存在内部最优值（3.85%），反映其对整体期望值的贡献相对较小且非单调。最优解附近解空间较为平坦，前七个最优解（D = 0.8061–0.8064）的脱色土和活性炭均接近上限，硅胶在3.85%–4.07%之间窄幅变化，表明配方对投料量的微小偏差不敏感。

由于研究时间限制未进行新的验证性脱色试验，研究人员采用留一法交叉验证（leave-one-out cross-validation），以最接近数值最优的现有设计点（Run 7：5%脱色土、5%活性炭、5%硅胶）进行验证。将该点从模型拟合中排除后，预测七个响应值并与实际观测值比较，所有七个观测值均落在对应的95%预测区间内，表明尽管部分响应的预测精度有限，模型在最优性能区域内未被独立数据点统计否定。

六、结论

本研究首次采用RSM系统评估了脱色土、活性炭和硅胶三种吸附剂在BS油脱色中的联合和交互效应，证明组合使用化学性质不同的吸附剂优于单独使用脱色土。活性炭在降低颜色指标方面优于脱色土，而脱色土在降低叶绿素含量方面更为有效；硅胶单独效果较弱，但在各种交互作用中发挥作用，体现了吸附剂的互补性。最优组合（5%脱色土、5%活性炭、3.85%硅胶）在改善氧化和色素品质的同时保留了中等水平的百里醌，这是单一吸附剂无法实现的。研究也指出了局限性：部分模型存在显著失拟和负的预测R2值，且两种吸附剂接近研究区域上限（5%），提示更高浓度可能进一步改善结果。未来研究需开展中试和工业试验、探索超过5%的吸附剂用量，并在实验设计中增加重复或中心点。总体而言，本研究验证了多吸附剂和多响应优化在BS油脱色中的可行性和优势，对特种籽油工业加工具有直接参考价值。