《Molecular Genetics & Genomic Medicine》：Identification of Variants in Two Families With Congenital Cataract by Whole Exome Sequencing
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背景：先天性白内障是一种出生时或婴儿早期诊断的眼科疾病，以严重视力损害和潜在失明为特征。本研究旨在评估两个变异的致病性：GJA8 c.201C>G（p.Asp67Glu）和CRYBB2 c.325A>T（p.Ile109Phe）。
方法：研究人员采
背景：先天性白内障是一种出生时或婴儿早期诊断的眼科疾病，以严重视力损害和潜在失明为特征。本研究旨在评估两个变异的致病性：GJA8 c.201C>G（p.Asp67Glu）和CRYBB2 c.325A>T（p.Ile109Phe）。
方法：研究人员采用裂隙灯摄影和B超检查患者晶状体。通过全外显子组测序和桑格测序鉴定变异。利用CLUSTALW进行多序列比对以评估受影响残基的进化保守性。采用AlphaFold2、PyMOL以及计算结构动力学方法（包括均方根波动和简正模式分析）对野生型和突变型蛋白进行结构建模和构象分析。
结果：在两个无血缘关系的家系中鉴定出两个可能致病的错义变异：家系1中，编码连接蛋白50的GJA8基因第2号外显子c.201C>G（p.Asp67Glu）为父系遗传；家系2中，CRYBB2基因第4号外显子c.325A>T（p.Ile109Phe）为新发变异。c.201C>G（p.Asp67Glu）变异定位于Cx50的第一个胞外环。结构建模显示Asp67-Arg185离子相互作用被破坏（Cα-OD距离从3.4 ?增加到4.9 ?），同时与Asn63形成新的氢键。突变体中RMSF降低表明EL1局部刚性化，可能损害通道门控功能，并与家系1受累成员的严重白内障表型相关。通过桑格测序结合表型分析，证实该变异在家系1内与患病表型共分离。CRYBB2中的c.325A>T变异（p.Ile109Phe）增加了蛋白质柔韧性，庞大的芳香族苯丙氨酸侧链扰乱了Greek key基序III的疏水核心，导致整体动态不稳定性。通过桑格测序结合家系2的表型分析，进一步证实CRYBB2 c.325A>T变异为新发突变。此外，多序列比对表明这两个残基在进化上高度保守。
结论：本研究扩展了先天性白内障的致病谱。研究结果为先天性白内障的分子诊断提供了新见解，并对遗传咨询具有重要意义。
研究背景与目的
先天性白内障（congenital cataract, CC）是以出生时或婴儿早期晶状体混浊为特征的眼科疾病，全球发病率约为每10万活产儿1.91至4.24例，约占全球儿童盲症的14%，是可预防儿童视力损害的主要原因之一。其病因具有异质性，包括遗传因素、产前感染、代谢紊乱和环境因素等，其中遗传易感性是主要致病机制。约75%的遗传性先天性白内障呈常染色体显性遗传。目前已发现超过100个基因与先天性白内障发病相关，功能上主要分为晶状体晶体蛋白基因（约占50%）和膜蛋白基因（包括连接蛋白和水通道蛋白，约占25%）。由于先天性白内障存在复杂的遗传和表型异质性，临床实践中建立可靠的基因型-表型关联面临巨大挑战。未经治疗的先天性白内障可能导致不可逆的视力丧失，因此及时的基因诊断和手术干预对于保护患儿视功能至关重要。尽管已有大量研究，但人类先天性白内障发生和发展的分子机制仍未完全阐明。本研究旨在通过全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）鉴定两个中国先天性白内障家系的致病基因变异，并通过结构建模和动力学分析探讨其潜在的分子致病机制。
研究方法与技术
研究人员主要采用了以下关键技术方法：对来自两个无血缘关系家系的研究对象采集外周血提取基因组DNA，使用Nano WES Human Exome V1捕获试剂盒进行杂交捕获，并在NovaSeq 6000平台进行双端测序。序列比对至人类参考基因组GRCh37/hg19，使用ANNOVAR和Enliven Variants Annotation Interpretation System进行变异注释和致病性分类。采用桑格测序进行家系共分离验证。利用CLUSTALW进行跨物种多序列比对分析进化保守性。通过AlphaFold2数据库获取野生型和突变型Cx50及CRYBB2蛋白的三维结构模型，并使用PyMOL进行可视化分析。采用CHARMM36m力场在OpenMM中进行能量最小化和结构优化，利用BioPython和MDAnalysis进行均方根波动和简正模式分析等结构动力学评估。
研究结果
3.1 临床特征
家系1中，女性先证者出生时即诊断为先天性白内障伴视力模糊，14岁时接受手术治疗。裂隙灯照片显示弥漫性均匀白色瞳孔区混浊，符合致密成熟性完全性白内障。B超显示晶状体内密集回声，视网膜平伏。术后最佳矫正视力双眼均为0.02，伴有轻度眼球震颤和双侧弱视。先证者父亲自幼患有双侧先天性白内障，19岁行白内障摘除术。先证者母亲视力正常但患有III级精神分裂症。先证者姐姐同样出生时患有双侧先天性白内障，1岁时行白内障摘除术，现伴有双侧眼球震颤、弱视和斜视，17岁时诊断为III级精神分裂症。先证者祖母出生后双侧视力差，12岁诊断为双侧先天性白内障。家系2中，4个月大女性婴儿表现为畏光和视觉行为异常，诊断为先天性白内障伴轻度眼球震颤和单侧听力损失，4个月时行双侧超声乳化术，父母均无眼部疾病表型。
3.2 变异鉴定、生物信息学分析与桑格测序验证
家系1中，WES在先证者中鉴定出GJA8基因的杂合错义变异c.201C>G（p.Asp67Glu）。该变异在大型人群数据库中缺失，多个计算机预测算法一致提示有害效应，桑格测序确认所有受累家系成员携带该杂合变异而健康成员为野生型，且该变异位于EL1高度保守区域并破坏Asp67-Arg185盐桥，ClinVar数据库中曾有先天性白内障病例报道，依据ACMG指南归类为可能致病。家系2中，WES在先证者中鉴定出CRYBB2基因的杂合错义变异c.325A>T（p.Ile109Phe）。该变异在人群中缺失，多个预测算法提示有害效应，桑格测序确认该变异为先证者新发突变，父母均为野生型，ClinVar数据库中曾有先天性白内障病例报道，依据ACMG指南归类为可能致病。
3.3 保守性分析与蛋白质结构分析
保守性分析显示GJA8基因的Asp67残基在多个物种中高度保守。Cx50 p.Asp67Glu突变位于第一个胞外环，野生型中Asp67与Arg185形成稳定盐桥，距离约3.4 ?；突变后谷氨酸侧链增加一个亚甲基，使Cα-OD距离延长至约4.9 ?，破坏了原有盐桥。分子动力学模拟显示突变显著降低了整体蛋白和突变位点周围残基的均方根波动值，导致EL1局部刚性化和柔韧性下降，可能损害通道门控功能，但简正模式分析表明全局折叠稳定性得以保持。该变异位于GJA8突变热点区域。
CRYBB2的Ile109残基在从哺乳动物到非哺乳类脊椎动物的广泛物种中进化不变。p.Ile109Phe突变位于Greek key III结构域，野生型中Ile109以其分支脂肪族构象精确嵌入疏水腔并与Ile124形成紧密疏水相互作用；突变为苯丙氨酸后引入刚性六元芳香环侧链，显著缩短与Ile124的空间距离并产生严重空间位阻，削弱了天然疏水相互作用并破坏疏水核心完整性。分子动力学模拟和简正模式分析显示该突变显著提高了整体蛋白和突变位点周围残基的RMSF值，导致全局柔韧性增强和局部结构刚性破坏。该错义变异位于CRYBB2突变热点区域。
讨论与结论
本研究中，GJA8基因编码的连接蛋白50组装成晶状体纤维细胞膜上的间隙连接通道，介导细胞间通讯并维持晶状体稳态。已报道超过146个GJA8致病性变异，多数为常染色体显性遗传或新发杂合错义改变。Cx50的胞外环是间隙连接通道功能的关键结构决定簇，EL1和EL2通过保守的二硫键、氢键和疏水相互作用介导半通道对接。家系1中所有受累成员均表现为双侧严重完全性白内障，不同于典型的核性白内障模式。Cx50 p.Asp67Glu突变位于EL1高度保守区域，破坏Asp67-Arg185稳定盐桥从而扰乱局部结构域架构，这种构象改变最可能干扰EL1结构内的二硫键配对，导致组装后的间隙连接通道功能丧失或运输受损，最终产生严重的完全性白内障表型而非经典核性白内障。
CRYBB2编码的βB2-晶体蛋白包含四个Greek key基序，约占晶状体总晶体蛋白的35%，是维持晶状体透明性和正常光学功能的关键组分。大多数致病性CRYBB2突变聚集于Greek key III和IV结构域，通常通过破坏蛋白稳定性和结构完整性发挥作用。本研究中CRYBB2 p.Ile109Phe突变将Greek key III基序疏水核心中高度保守的异亮氨酸替换为具有庞大芳香族侧链的苯丙氨酸，这种非保守置换破坏了Greek key基序的内部疏水性，同时苯丙氨酸芳香环的空间位阻扭曲了局部β-折叠，显著增加局部构象不稳定性，最终通过蛋白聚集导致先天性白内障。
结论：本研究在一个中国家系中鉴定了Cx50的可能致病性变异c.201C>G（p.Asp67Glu）以及在另一个中国散发性先天性白内障患者中鉴定了CRYBB2的新发可能致病性变异c.325A>T（p.Ile109Phe）。这些发现拓宽了GJA8和CRYBB2的突变谱，丰富了先天性白内障的表型-基因型关联，为先天性白内障的分子诊断提供了新见解，并对遗传咨询具有重要意义。
