单分子实时测序技术在脊髓性肌萎缩症临床诊断中的应用研究

《Molecular Genetics & Genomic Medicine》：Clinical Practice of Single-Molecule Real-Time Sequencing in the Diagnosis of Spinal Muscular Atrophy

目的：利用单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT）研究脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）中SMN1基因的分布比例，为SMA基因分型提供补充证据。 方法：对771名同时接受实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）和SMRT测序检测的研究对象进行回顾性分析，并进行统计学分析。 结果：在纳入的771名个体中，男女比例为2:3，中位年龄为31岁。实时荧光定量PCR与SMRT测序的检测结果完全一致。采用SMRT测序，SMN1拷贝数为1、2、3和4的样本比例分别为2.33%（18/771）、91.18%（703/771）、6.36%（49/771）和0.13%（1/771）。对于SMN2，拷贝数为0、1、2、3和4的比例分别为6.10%（47/771）、33.07%（255/771）、57.59%（444/771）、2.98%（23/771）和0.26%（2/771）。SMN1缺失的携带者频率为2.33%（18/771）。此外，研究人员还利用SMRT测序分析了4例SMA患者。结果表明，该技术能够准确检测SMN1和SMN2拷贝数，为患者诊断和临床管理提供重要信息。 结论：SMRT测序与qPCR结果完全一致，能够准确检测SMN1和SMN2拷贝数，为SMA的人群预防、遗传咨询和临床管理提供有力的技术支撑。

论文解读

一、研究背景与目的

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传的进行性运动神经元疾病，以肌无力、肌张力低下和进行性萎缩为主要特征，是婴幼儿期第二常见的致命性常染色体隐性遗传病。SMA的致病基因为运动神经元存活基因1（survival motor neuron 1，SMN1）。该基因编码的SMN蛋白对运动神经元的存活和功能维持至关重要。SMN1与SMN2具有高度同源性，但SMN2外显子7的c.840位点存在单个核苷酸差异，改变了前体mRNA的剪接方式，导致其编码的蛋白主要为截短型且无功能。SMN1的纯合缺失或突变可导致SMA。一般人群中SMN1缺失的携带者频率约为1/50。由于双方均为携带者的夫妇有1/4的概率生育患病子女，因此SMN1携带者筛查对于预防患病儿童出生和降低遗传风险具有重要的公共卫生意义。

目前SMA的常用基因检测方法包括定量PCR（quantitative PCR，qPCR）和多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）。qPCR可检测SMN1纯合缺失，但无法检测精确拷贝数或点突变；MLPA可可靠检测SMN1和SMN2拷贝数及外显子重排，但无法确定单倍型或点突变。单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing，SMRT）作为第三代测序技术，利用长读长直接对高度同源的SMN1/SMN2区域进行测序，可实现单倍型水平的分析，准确确定拷贝数和关键点突变（如SMN1 1+1^D、2+1^D）。对于2+0携带者，SMRT测序比qPCR或MLPA能更精细地区分单倍型，但最终判定仍依赖家系连锁分析和间接推断。为评估其在携带者筛查中的临床应用价值，研究人员将其应用于入组样本检测，并以qPCR作为参照，为SMA诊断中该技术的推广应用提供证据。

二、主要技术方法

本研究采用以下关键技术方法：

1. 1.
   样本队列来源：共纳入2024年6月至2025年11月期间在该中心接受常规孕前SMA携带者筛查或健康体检的771名个体（中位年龄31岁，男女比例约2:3），用于携带者频率估算。另纳入4例经qPCR确诊的SMA患者作为独立验证病例进行诊断一致性分析，但不纳入携带者频率计算。
2. 2.
   SMRT测序：从外周血提取基因组DNA，采用第三代测序SMA检测试剂盒（贝瑞基因，中国北京）进行长片段PCR扩增，覆盖全长SMN1和SMN2基因及其下游区域。扩增产物经末端修复、磷酸化后与带条形码的PacBio接头连接形成哑铃型文库，在Sequel II CNDx平台（Pacific Biosciences，美国加州）上以CCS模式测序30小时。通过生物信息学软件生成高保真环化共有序列（circular consensus sequencing，CCS）读段，比对至参考基因组进行变异鉴定。该方法可同时确定SMN1和SMN2拷贝数并完成全长约28.5 kb测序，通过c.840位点明确区分两个基因。
3. 3.
   qPCR验证：提取外周血DNA，按照SMN1外显子缺失检测试剂盒（天隆，中国西安）说明书配制体系，检测SMN1外显子7和外显子8，采用实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国加州）进行扩增，以??Ct法计算拷贝数，以基因组参照和芯片内批次对照进行归一化。

三、研究结果

3.1 所选样本的总体统计

771名个体同时接受qPCR和SMRT测序分析，两种方法在所有样本中的结果完全一致（100%一致率）。SMRT测序数据显示，最常见的组合为SMN1:SMN2拷贝数比值为2:2，占55.25%（426/771），其次为2:1，占29.44%（227/771）。SMN1拷贝数为1、2、3和4的样本比例分别为2.33%（18/771）、91.18%（703/771）、6.36%（49/771）和0.13%（1/771）。共检出18名SMN1缺失携带者，携带者频率为2.33%（18/771）。SMN2拷贝数为0、1、2、3和4的比例分别为6.10%（47/771）、33.07%（255/771）、57.59%（444/771）、2.98%（23/771）和0.26%（2/771），其中47名个体（6.10%）存在SMN2纯合缺失。

3.2 病例报告

共纳入4例经qPCR确诊的SMA患者作为独立验证病例，进行SMRT测序与传统方法的一致性分析。

患者1为16岁女性，影像学显示严重脊柱侧凸。qPCR显示SMN1外显子7和外显子8纯合缺失；MLPA确认SMN1零拷贝、SMN2三拷贝；SMRT测序进一步验证了SMN1拷贝数缺失（0拷贝）和SMN2拷贝数增加（3拷贝），筛查区域内未检出致病性点突变。该患者于12月龄开始出现双手震颤等症状，但可在支撑下站立，16岁时出现弛缓性瘫痪和脊柱侧凸，此前15年未接受规范化治疗。根据文献报道，该患者被诊断为II型SMA。

患者2为12岁男性，17月龄时无法独立行走，伴有脊柱侧凸。体格检查显示上肢近端肌力2/5级、远端3+/5级伴肌张力降低，双下肢肌力2/5级伴肌张力低下，膝反射和踝反射消失，右侧髋关节和膝关节外翻畸形伴右下肢内收受限。qPCR显示SMN1外显子7和外显子8纯合缺失；SMRT测序确认SMN1零拷贝、SMN2三拷贝。根据发病年龄和临床表现，诊断为II型SMA。

患者3为17岁男性，表现为脊柱弯曲异常且正常脊柱轮廓消失，双上肢屈曲挛缩、全身肌张力低下和瘫痪，上肢肌力II级、下肢肌力0级。qPCR显示SMN1外显子7和外显子8纯合缺失；SMRT测序确认SMN1零拷贝、SMN2三拷贝，筛查区域内未检出致病性点突变。综合评估后诊断为I型SMA。

患者4为3月龄男性，出生后即出现全身肌张力低下。qPCR确认SMN1外显子7和外显子8纯合缺失；SMRT测序验证SMN1零拷贝、SMN2两拷贝，筛查区域内未检出致病性点突变。肌电图显示双侧正中神经、尺神经、胫神经和腓总神经运动及感觉神经纤维损伤。根据临床表现和诊断结果，依据既定指南诊断为I型SMA。

四、讨论总结

SMA是由SMN1缺失或突变引起的脊髓前角细胞和脑干运动核进行性退变，患者表现为肌无力、肌张力低下和进行性萎缩。SMA的诊断依赖于分子遗传学检测，常用方法包括qPCR和MLPA，但传统检测方法无法同时检测SMN1/SMN2拷贝数和SMN1点突变。SMRT测序是一种无需扩增的单分子测序技术，具有超长读长、无GC偏好性以及可准确测序高度重复序列等复杂区域的优点，能全面覆盖各类变异类型，大幅降低漏诊率。SMRT测序已在地中海贫血和先天性肾上腺增生症等疾病基因检测中成熟应用，但用于SMA的临床应用仍有限。

本研究结果显示，SMRT测序与qPCR在拷贝数缺失判定上完全一致，且能提供SMN1/SMN2拷贝数的精确信息。研究中SMN1缺失携带者频率为2.33%，接近中国人群报道的1.2%–2.2%范围。研究人群中SMN1双拷贝为最常见基因型（91.18%），但6.36%的人群携带三拷贝、0.13%携带四拷贝，提示这些个体的一条染色体上可能携带至少两个SMN1基因，其后代可能为沉默携带者（2+0）。但2+0状态的最终确认需要基于家系的单倍型分析。这一发现提示，若仅采用传统qPCR方法筛查，高SMN1拷贝数个体可能面临被低估的生殖风险。

SMRT测序在分析SMN1的同时可同步直接计算SMN2拷贝数。本研究发现人群中SMN2双拷贝个体占57.59%，单拷贝占33.07%，另有2.98%和0.26%的个体分别携带三拷贝和四拷贝。SMN2虽可编码SMN蛋白，但由于外显子7的沉默突变，大部分转录本翻译为截短型且无功能的SMN蛋白（SMN-?7），极不稳定并迅速降解。每个SMN2拷贝仅能产生约10%的功能蛋白，因此SMN2被视为疾病严重程度的修饰基因。既往研究已确立SMN2拷贝数与SMA患者临床严重程度呈反比关系。

本研究中4例SMN1纯合缺失患者中有3例携带SMN2三拷贝，但三者的SMA类型并不完全一致，其中两例出生6个月后发病，表现为可独坐但无法独立站立和脊柱侧凸等典型症状，一例I型SMA患者发病更早。这表明三拷贝SMN2患者的临床表型具有异质性。文献报道三拷贝SMN2患者临床谱广泛，从重型（I型）到轻型（IIIc型）均可见。Calucho等人分析了1627例三拷贝SMN2的SMA患者，发现15%为I型、54%为II型、31%为III型，进一步支持该拷贝数相关的高度变异性。同时，在同一临床亚型内，SMN2拷贝数较多的患者症状较轻。但文献也报道，携带四或五拷贝SMN2的患者中分别有1%和5%表现为I型SMA，提示SMN2拷贝数与疾病严重程度并非简单负相关，不同SMN2变异体可能具有不同功能特性，或SMN2内的修饰突变可能影响其代偿能力，其机制尚不清楚，有待进一步研究。

SMRT测序可准确识别点突变，但本研究人群未检出此类变异。文献报道SMA携带者中SMN1点突变（1+1^D或2+1^D）约占2%。这一现象可能反映这些变异在人群中的真实低发生率，但也提示当前样本量可能不足以对此类罕见事件做出稳健的统计学推断。因此，后续扩大检测范围对于准确评估此类罕见基因型分布和该技术筛查效能至关重要。

五、结论

SMRT测序不仅能够精确检测SMN1和SMN2拷贝数，还可同时检测多种基因变异。SMA致病基因检测已从单位点检测发展到全基因组检测。SMRT测序的广泛应用有望显著提高筛查的覆盖面和准确性，为SMA的人群预防和遗传咨询提供更有力的技术支撑。未来大规模研究将进一步验证其在SMA罕见基因型检测中的综合效能。