高风险横纹肌肉瘤具有趋同的细胞状态

《Cancer Research》：High-Risk Rhabdomyosarcomas Feature a Convergent Cell State

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摘要

体细胞突变通常可预测儿童癌症的生存率，以横纹肌肉瘤（RMS）为例，其中FOXO1基因融合状态是一个关键的预后特征。在本研究中，我们分析了单细胞转录组，发现致死性疾病的癌细胞汇聚于一种共同的细胞状态，具有共享的转录景观，而与融合状态无关。核转录组学、染色质可及性、空间转录组学、扰动实验以及先前发表的数据集均验证了这一高风险细胞状态。该汇聚的细胞状态与FOXO1融合的转录效应仅有部分重叠，并出乎意料地表现出神经特征。总体而言，这些发现描绘了一种超越传统分子和组织学边界的高风险RMS细胞状态，暗示了一种全面的疾病表型，可能会改变靶点发现并指导临床实践。

意义：定义一种超越现有组织学和分子特征（可预测预后结果）的高风险横纹肌肉瘤汇聚细胞状态，为侵袭性疾病提供了生物学见解，并发现了潜在的生物标志物和治疗靶点。

引言

横纹肌肉瘤（RMS）是一种儿童软组织癌症，以骨骼肌分化异常为特征（1–3）。年龄、疾病部位和肿瘤扩散等多种参数决定了RMS的预后结果。然而，影响最大的预后因素是涉及FOXO1基因的体细胞重排的存在，该基因通常与PAX3或PAX7配对。由此产生的基因融合作为致癌转录因子（TF）发挥作用，扰乱肌肉细胞发育，并带来特别差的预后（4, 5）。在形态上，大多数融合阳性肿瘤呈现"腺泡状"组织学特征（类似于肺泡），而融合阴性肿瘤通常呈现"胚胎状"外观（类似于发育中的肌肉细胞；参考文献6）。因此，在FOXO1基因融合被发现之前，腺泡状外观已与不良预后相关联（7）。鉴于融合的存在对生存率的深远影响，在当前的临床实践中，只要能够确定融合状态，组织学不再作为独立的风险因素。融合阳性和融合阴性肿瘤之间一个基本的生物学差异是它们表现出的肌肉分化程度，这是基因融合的直接效应。携带融合的细胞通常表现出成熟骨骼肌的免疫组化（IHC）标志物，而胚胎状肿瘤则更像原始肌肉细胞（8, 9）。近期的研究通过单细胞转录组学检查RMS细胞的分化，证实了融合阳性和融合阴性RMS细胞之间的这一差异（10–14）。总体而言，这些研究表明，RMS细胞相对于人类胎儿肌肉细胞的成熟度存在显著差异，这超越了融合阳性细胞与更成熟细胞的相似性。例如，在胚胎状、融合阴性的癌细胞中已描述了间充质细胞状态。当融合阴性RMS致死时，这可能由多种因素解释，如诊断时疾病已进展、原发灶治疗的解剖学挑战（例如解剖学不可及区域）或特定的遗传特征，如MYOD1 L122R热点突变（15）。鉴于FOXO1融合对肌肉分化的深远影响，我们假设可能存在一种侵袭性疾病的癌细胞状态。我们在RMS儿童队列中利用单细胞mRNA、核RNA测序（RNA-seq）结合转座酶可及染色质分析（ATAC）、单细胞空间读数以及扰动实验来验证这一假设。

材料与方法

样本获取和患者特征

RMS肿瘤和匹配的血液样本在英国伦敦的大奥蒙德街医院收集，符合机构研究伦理委员会的指导方针。每个标本均经过专家病理学家的详细病理审查。获取了详细的临床信息（就诊年龄、性别、肿瘤部位、分期等）。还收集了截至2024年9月10日的结局数据。总体而言，患者的临床特征和人口统计学特征符合RMS的典型表现：诊断时的平均年龄为5.3岁（0–12岁）；男女比例为3:1。更多信息见补充表S1。

伦理声明

本研究按照公认的伦理指南进行。组织通过英国（UK）国家医疗服务体系（NHS）研究伦理委员会批准的研究收集，并按照适用的英国健康研究和人体组织研究的伦理和法规要求进行。其中包括NHS研究伦理委员会审查和相关的人类组织法2004。患者或监护人按照研究方案的规定提供了书面知情同意参与本研究。这些研究的参考文献如下：NHS国家研究伦理服务参考号16/LO/0960和NHS国家研究伦理服务参考号16/EE/0394。额外的存档样本由VIVO生物库（前身为儿童癌症和白血病组）提供，NHS国家研究伦理服务参考号23/EM/0130。

肿瘤组织处理和10x Chromium分析用单细胞悬浮液制备

在诊断性活检或手术切除过程中获得的多余肿瘤组织，在取出后1小时内在组织病理学实验室进行处理。组织样本到达后，使用手术刀细碎切割，并在使用RPMI 1640培养基补充20%胎牛血清和1% L-谷氨酰胺中孵育。加入IV型胶原酶（1.6 mg/mL；产品编号#11410982，MP Biomedicals），混合物在37°C下维持30分钟，每10分钟翻转一次。酶消化后，将所得材料通过70 μm细胞过滤器过滤，随后使用1×红细胞裂解缓冲液（产品编号#420301；BioLegend，RRID: SCR_001134）在环境温度下进行10分钟的红细胞裂解。所得的单细胞悬浮液用于后续应用。在某些情况下，通过使用CD45 MicroBead Kit（产品编号#130-045-801；Miltenyi Biotec，RRID: AB_2783001）按照制造商说明去除CD45+细胞来实现肿瘤细胞富集。对于进行CD45耗竭的样本，耗竭和非耗竭部分随后均使用Dead Cell Removal Kit（产品编号#130-090-101；Miltenyi Biotec）按照方案处理，以消除非存活细胞。在未进行CD45耗竭的情况下，完整的单细胞悬浮液直接处理。最终存活细胞悬浮液（包括CD45耗竭和非耗竭制备）被装载到10x Genomics Chromium平台（RRID: SCR_019326）上进行下游分析。

10x文库制备和测序

使用血细胞计数板手动计数单细胞悬浮液，并调整至1,000细胞/μL的浓度。随后按照Chromium Single Cell 3' Kit（v2和v3化学法）或Chromium Single Cell 5' kit（仅R2）的标准方案处理细胞。所有后续步骤均按照制造商说明进行。来自5至8个10x芯片位点（通道）的文库进行池化，并在Illumina NovaSeq 6000（RRID: SCR_016387）上使用150 bp S4 flow cell的一条通道进行测序。

单细胞RNA-seq数据的比对和处理

单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据比对到GRCh38（v1.2.0）人类参考基因组，并使用cellranger（v8.0.0，RRID: SCR_017344）进行定量分析。根据每细胞检测到的基因数（>500）和映射到线粒体基因的reads百分比（10%–15%）去除低质量细胞，其中阈值根据测序质量进行调整。对两个质量特别差的样本——FN_MYOD1_2和FN_OTHER_8——进行了额外的质量控制。对于FN_MYOD1_2，我们发现可能的双细胞率膨胀，且许多细胞基因计数质量差。为确保去除双细胞，我们丢弃了基因数>8,000的细胞，并使用基于唯一分子标识符（UMI）的计数指标（#基因/总计数）去除基因数较少的细胞。对于FN_OTHER_8，我们去除了>10% reads映射到核糖体基因的细胞，这些细胞似乎形成了一个低质量细胞簇。原始计数矩阵使用scanpy（v1.11.3，RRID: SCR_018139；参考文献16）进行处理，包括过滤在少于20个细胞中表达的基因、每百万计数（CPM）标准化和对数转换。标准化后的计数用于主成分分析（PCA）、均匀流形近似与投影（UMAP）和leiden聚类。使用Scrublet（v0.2.3，RRID: SCR_018098；参考文献17）进行双细胞检测，所有评分（包括细胞周期基因）均使用scanpy完成。根据经典标志物的表达注释细胞（补充图S1）。不含癌细胞的样本被排除在分析之外。同一患者（FN_OTHER_7）的两个样本（诊断和难治性）被合并进行分析，因为诊断样本中不含癌细胞。

多组学单核RNA和ATAC-seq样本制备

冷冻于最佳切割温度（OCT）中嵌入的组织在50 μm厚度处切片。切片直接转移到含有0.5 mL匀浆缓冲液的Dounce匀浆器中，静置3分钟以促进OCT化合物的溶解。随后进行两步机械解离：首先使用松质杵进行粗匀浆，然后使用紧质杵进行细匀浆。匀浆材料通过40 μm细胞过滤器过滤以去除大碎片。所得悬浮液在4°C、500 × g下离心6分钟，加速设置为0，减速设置为3。小心去除上清液，将沉淀重新悬浮于0.5 mL洗涤缓冲液中。随后使用C-chip一次性血细胞计数板进行核计数。样本然后在4°C、500 × g下进行第二次离心5分钟。去除第二次上清液后，将沉淀重新悬浮于100 μL的10x Genomics 0.1×裂解缓冲液中，在冰上孵育2分钟。随后加入500 μL的10x Genomics Wash Buffer 2，并轻柔混合。使用C-chip一次性血细胞计数板进行第二次核计数。再次收集细胞核并重新悬浮至目标浓度（用于核回收的7,000个核），使用10x Genomics稀释的核缓冲液补充1 U/μL的保护酶。随后按照制造商在Chromium Next GEM Multiome ATAC + Gene Expression用户指南（10x Genomics；文件CG000338）中概述的说明继续操作。

单核ATAC-seq数据的比对和处理

单核RNA-seq数据比对到GRCh38-2020-A人类参考基因组，并使用cellranger-arc流程（v2.0.1，RRID: SCR_023897）进行定量分析。我们还去除了两名具有异常临床史的患者以及不含癌细胞的样本。按患者合并技术重复样本，生物学重复样本（同一肿瘤的多块组织）在分析中保持分离（样本ID为"-1"或"-2"）。仅包含有信心的标签细胞进行分析。数据的基因表达组分使用scanpy（16）按照与单细胞数据相同的处理步骤（如上所述）进行处理，但过滤在少于10个细胞中表达的基因。去除Scrublet（17）检测到的双细胞（如果形成明显的簇），去除含有>50,000 UMIs的细胞。根据经典标志物的表达注释细胞（补充图S1）。不含癌细胞的样本被排除在分析之外。数据的ATAC组分在去除细胞中片段百分比低或峰值中片段百分比低的样本后单独处理（基于10x提供的"错误"阈值）。使用SnapATAC2（v2.8，RRID: SCR_026622；参考文献18）处理原始片段，使用GRCh38参考基因组，其中在合并所有样本之前对每个样本进行基本质量控制，然后按细胞标签使用MACS3（RRID: SCR_013291，细胞标签：基质、免疫、骨肉瘤、促纤维增生小圆细胞瘤（DSCRT）、融合阴性RMS、融合阳性RMS，以及死于疾病的融合阴性RMS患者的融合阴性RMS细胞；参考文献19）进行峰值检测。质量控制包括去除双细胞、细胞过滤（tsse >5）和功能选择至50,000个特征。细胞注释标签取自基因表达分析，其中细胞同时存在于基因表达和ATAC组分数据中。任何仅存在于ATAC组分的细胞（即仅有ATAC读数的细胞）通过产生基因矩阵（与基因重叠的ATAC读数），使用SnapATAC2的make_gene_matrix()函数进行注释，用于聚类和观察经典标志物基因。使用pychromVAR（v0.0.4，RRID: SCR_027456）计算转录因子可及性评分，使用2020版pyJASPAR中的TF基序（20, 21）。pychromVAR的默认设置应用于基质、免疫、汇聚型（来自融合阳性和致死性融合阴性患者）和多样型（来自融合阴性患者）细胞。

用于绘制ATAC覆盖度轨道，从SnapATAC2导出bigWig文件，并使用pyGenomeTracks（19）对覆盖度和GTF轨道进行可视化。全基因组和bulk RNA-seq的DNA及RNA提取

DNA从新鲜冷冻组织中提取。在可能的情况下，使用外周血DNA作为匹配的对照。按照厂家方案使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit（QIAGEN）提取总DNA和RNA。冷冻组织样品，无论是50 μm的OCT包埋切片还是约3至20 mg的未包埋冷冻组织，均在干冰上转移至2 mL Precellys匀浆管中。向每管中加入350 μL含2 mol/L二硫苏糖醇的Buffer RLT Plus缓冲液。使用Precellys 24 Touch匀浆仪在6,000 rpm下匀浆30秒。匀浆后的样品在10,000 rpm下离心1分钟以去除泡沫，然后将上清液转移至2 mL Eppendorf管中。随后使用QIAcube（QIAGEN, RRID: SCR_020414）进行自动化纯化，采用AllPrep DNA/RNA Mini Kit的专用程序。所有步骤均按照预编程入QIAcube系统的默认方案执行，以确保最佳的试剂处理、柱处理及洗脱条件。提取完成后，每个样品获得两种独立的洗脱液：一种含基因组DNA，另一种含总RNA。每种洗脱液分别收集于1.5 mL Eppendorf管中。使用Agilent 4200 TapeStation系统（RRID: SCR_018435）进行质量控制和完整性评估。基因组DNA样品使用Genomic DNA ScreenTape检测试剂盒（Agilent，货号#5067-5365）评估，RNA样品使用High Sensitivity RNA ScreenTape检测试剂盒（Agilent，货号#5067-5579）评估以确定RNA完整性数值（RIN）。DNA样品储存于?20°C，RNA样品储存于?80°C，直至后续处理。全基因组测序与比对

使用Illumina标准PCR法全基因组测序（WGS）文库制备方案制备短插入片段（约500 bp）的基因组文库。然后将流动池上机，在Illumina NovaSeq 6000平台上生成150 bp双端测序簇。测序采用每个S4流动池通道6个样品的通量。WGS输出数据使用Cancer Genomics Pipeline（CGP）标准工具进行处理，以确保高质量且可重复的结果。测序reads使用BWA-MEM v0.7.17（RRID: SCR_010910）比对至GRCh38参考基因组，使用samtools markdup（RRID: SCR_002105）识别并标记重复reads。在以下所有变异检测流程中，对于缺乏匹配正常组织的样品，使用人工参考PDv38is_wgs。变异检测与注释

点突变、插入和缺失

使用CaVEMAN v1.15.2（RRID: SCR_017089）鉴定体细胞点突变。对变异进行过滤，仅保留具有PASS过滤状态且位于外显子或剪接位点区域的变异。点突变还通过CLPM（支持变异的reads中软剪切的碱基数中位数）和ASMD（显示变异等位基因的reads的比对分数中位数）过滤器进行进一步过滤（CLPM = 0且ASMD ≥ 140）。VCF文件在R中使用vcfR包进行处理。将所得变异与COSMIC Mutant Census（22）v99（GRCh38）使用复合键（染色体、位置、参考等位基因和替代等位基因）进行匹配。使用Pindel（v01, RRID: SCR_000560）检测小插入和缺失（indel）。对注释后的VCF文件进行过滤，仅保留具有PASS状态的变异，并使用vcfR包（RRID: SCR_023453）进行解析。仅保留位于蛋白编码外显子中且预测会导致非同义蛋白变化的indel。变异用基因名称和蛋白后果进行注释，并按变异长度和类型进行分类。与COSMIC（22）进行交叉比对以识别癌基因中的改变（RRID: SCR_002260）。结构变异

使用BRASS v6.3.4（CASM IT）、GRIDSS（23）v2.13.1-gridss（RRID: SCR_027130）和GRIPSS v2.0（HMFtools）鉴定结构变异（SV），以增强各类变异的敏感性。来自BRASS的SV使用自定义R脚本处理，按变异类型（缺失、倒位、串联重复、易位和扩增）进行分类，并使用Ensembl基因坐标（RRID: SCR_002344）进行基因背景注释。功能注释来源于COSMIC Cancer Gene Census（22），将基因伙伴归类为融合基因、癌基因（OG）、抑癌基因（TSG）或未分类。基于规则的系统优先选择涉及关键癌基因的SV（例如与TSG重叠的缺失和涉及OG的串联重复）。与此同时，从GRIPSS过滤后的VCF中使用StructuralVariantAnnotation R包（RRID: SCR_018683）对SV进行注释。VCF被导入并转换为GRanges和BEDPE格式，保留EVENTTYPE、AS、RP和SR等字段。仅保留具有PASS状态的常染色体或性染色体SV。染色体间SV按大小（>500 bp）和等位基因分数（500–30,000 bp为≥300；>30,000 bp为≥250）进行过滤；染色体间事件要求等位基因分数≥300。所有SV需要≥4个支持reads对和≥2个拆分reads。SV断裂点与Ensembl基因坐标重叠，并评估是否涉及COSMIC基因（22）。高置信度SV定义为RP≥50或SR≥25，或两者同时满足以实现严格筛选。拷贝数改变

使用Hartwig Medical Foundation工具包的工具进行拷贝数分析。使用AMBER（v4.1.1, RRID: SCR_027131）和COBALT（v2.0）分别估算等位基因特异性拷贝数和覆盖度。最终分段和解释使用PURPLE（v4.1, RRID: SCR_022999）进行，整合B-等位基因频率和reads深度。体细胞拷贝数片段使用COSMIC Cancer Gene Census基因（22）进行功能注释。片段被分类为增益（拷贝数>2.5）、缺失（<1.5）、拷贝中性的杂合性丧失（总拷贝数1.7–2.4且次要等位基因拷贝数<0.5）和复杂增益-缺失区域。根据片段在样品间的频率鉴定反复改变的区域，并在基因和细胞遗传学带水平进行总结。具有相同拷贝数状态且连续基因组坐标的相邻片段被合并以定义更大的改变块。这些改变与COSMIC注释（22）进行交叉比对，以评估观察到的变化是否发生在更广泛的拷贝数变异区域内，还是代表孤立的断裂点级别事件。每个事件的大小和分类均相应记录。Bulk RNA-seq的RNA处理

识别并处理对应于每个样品的双端FASTQ文件。使用BBDuk（RRID: SCR_016969）对reads进行质量和接头修剪。修剪后的reads使用STAR（RRID: SCR_004463；参考24）比对至人类参考基因组，采用ENCODE推荐的RNA-seq比对参数。STAR基因组索引基于GRCh38_v32注释（RRID: SCR_014966）。链特异性使用STAR生成的ReadsPerGene.out.tab文件评估。计算映射到正向链和反向链的总reads数，以及无链reads数。使用链偏向比将文库分类为无链、正向链或反向链。使用三种方法估计表达水平（原始计数）：RSEM（RRID: SCR_000262）：使用STAR生成的转录组BAM文件进行转录本和基因水平表达定量。根据链分类结果传入链特异性参数。featureCounts（RRID: SCR_012919）：从坐标排序的BAM中提取唯一且一致映射的reads对，然后按名称排序。使用featureCounts和GTF注释文件计算基因水平计数，并适当传入链信息。Salmon（RRID: SCR_017036）：使用了两种基于Salmon的定量策略。首先，直接从修剪后的FASTQ文件使用Salmon的–validateMappings模式对转录组进行选择性比对。其次，使用–useAlignment模式从转录组比对的BAM文件进行定量。使用STAR-Fusion（RRID: SCR_025853）鉴定潜在的基因融合。使用此前经BBDuk处理的修剪后双端reads作为输入。STAR-Fusion以默认参数运行，配置为使用FusionInspector验证融合、从头重建候选融合转录本，并评估每个融合事件的潜在编码影响。原始计数使用edgeR（v3.42.4, RRID: SCR_012802；参考25）进行处理，包括文库大小标准化和对数转换以提供logCPM值。仅保留在至少30%的病例中logCPM>0.5的基因。所有bulk RNA样品的基因模块评分使用singscore（v1.20；参考26）进行。外部数据集处理

人类细胞图谱（RRID: SCR_016530；参考27–29）中三个项目的原始计数数据经合并后使用scanpy（同上；参考16）进行处理，此前已去除在少于15个细胞中表达的基因。该合并的胎儿肢体图谱用于推导间质谱系的特征。我们下载了三组原始单细胞或单核RNA-seq计数数据：Massachusetts General Hospital（11）、St Jude（10）和Princess Maxima Centre（13）。数据集分别使用scanpy（v1.11.3）处理，包括过滤在少于10个细胞中表达的基因、CPM标准化和对数转换。我们将分析限制在原始RMS肿瘤样品中，排除了细胞系和异种移植瘤（患者来源的异种移植瘤），以最好地反映我们的队列并确认收敛细胞状态在体内的存在。我们获取了三组原始bulk RNA-seq计数数据：NIH（6）、St Jude（30）和Princess Máxima Centre（31）。对每组数据，使用edgeR（v3.42.4, RRID: SCR_012802；参考25）处理原始计数，包括过滤低表达基因和计算logCPM。所有bulk RNA样品的模块评分使用singscore（v1.20；参考26）进行。除Meister及其同事（31）提供的患者来源肿瘤类器官bulk数据外，所有样品均来自原始肿瘤样品，该类器官数据被发现可再现融合阳性和阴性表型。利用人类细胞图谱推导间质谱系基因模块

为从胎儿图谱（27）中获得每种间质谱系特异性基因模块，我们首先将"骨软骨"细胞标签拆分为"软骨衬里"[中间区1和2细胞，关节软骨祖细胞（CC）]、"软骨肥大"（静止CC、肥大CC、前肥大CC、增殖CC、早前期静止CC、循环CC和循环祖细胞）、"骨皮质"（成熟骨膜、成骨前细胞1和2、软骨膜、早期骨膜、MMP9骨膜和骨细胞）和"骨成骨细胞"（成熟成骨细胞、早期成骨细胞和HEY1成骨细胞），因为我们预期这些类别具有独特的表达信号（补充表S2）。我们使用scanpy rank_genes_groups函数中的Wilcoxon方法鉴定每种细胞类型的特异性基因。我们分别提取每个测序批次（5′或3′）的前500个基因，并按细胞类型类别取交集。使用每个类别的前列基因，我们进一步过滤为在每种细胞类型类别中大量细胞中高表达而在其他无关细胞类型中低表达的基因。为确保基因特异性于每种细胞类型，移除了模块之间重叠的任何基因。假基因和长非编码基因也被移除。为计算间质"其他"综合评分，我们取五个模块——肌腱、纤维、软骨（衬里）、软骨（肥大）和骨（皮质）——的z标准化评分平均值，排除生物学上无关或在患者间表达量低的模块。评分与参考细胞和其他肿瘤细胞（Ewing肉瘤、DSCRT和骨肉瘤）一起进行z标准化以提供上下文。收敛度量指标为肌肉评分与综合评分之间的log2比值，具有收敛度量指标>0的细胞被认为是"已收敛"的。由于肌肉模块仅包含10个基因，收敛度量指标提供了相对于其他间质信号量化向肌肉收敛的稳健方法，使其可跨数据模态和队列应用。收敛度量指标依赖更多基因（提高评分稳定性），校正异质性间质背景，并相对于个体间质基线标准化肌肉身份以减少跨模态的技术变异。利用发现队列推导高风险基因模块

为推导高风险基因模块，我们寻找在高危患者簇中相对于预后良好的融合阴性患者上调的基因。由于标准化无法解决我们相对较小的队列中细胞数量差异悬殊的问题，我们无法进行拟批量差异表达分析。我们转而选择差异比例分析，以评估哪些基因在融合阳性或致命性融合阴性患者与融合阴性患者之间表达该基因的细胞比例增加。我们去除含有少于200个细胞的样品（去除了融合阴性的肺泡型患者），并基于平均比例比≥2过滤基因，以优先选择绝对差异较大的基因。我们通过过滤在至少半数高危患者中>15%的细胞中表达且在至少半数非高危患者中<15%的细胞中表达的基因来确保表达特异性。

我们还去除了长链非编码基因、核糖体基因和低表达基因。基因根据其与肌肉谱系、神经谱系或混合/其他谱系的关联进行注释。若要将基因注释为肌肉或神经类型，该基因需在发育脊髓图谱中表现出谱系特异性、在人类蛋白质图谱（HPA；参考文献32）中有表达，并有文献支持。使用clusterProfiler（33）的默认设置（minGSSize = 10，maxGSSize = 500）对基因本体论（GO；RRID: SCR_002811）的"生物学过程"术语进行了过度表示分析。P值采用Benjamini-Hochberg校正进行修正。

扩增队列的差异表达分析

我们使用扩增队列在趋同细胞与多样细胞之间进行伪批量差异表达分析。若细胞的趋同指标>0，且来自融合阳性患者或死于疾病的融合阴性患者，则将该细胞归类为趋同细胞。若细胞的趋同指标<0，且来自未死于其疾病的融合阴性患者，则将该细胞归类为多样细胞。细胞数少于250例的患者被移除。计数被汇总为每个样本的伪批量谱，提供了15个来自死于疾病的患者的"趋同"谱和12个来自未死于疾病的患者的"多样"谱。使用sumTechReps()函数对重复样本进行求和。若基因在至少20%的样本中具有logCPM≥0.5，则予以保留。使用edgeR（v3.42.4；参考文献25）中的拟似然框架，基于FDR阈值为0.05且采用Benjamini-Hochberg P值校正，鉴定差异表达基因。在趋同细胞中上调的1,826个基因中，有30个转录因子存在于chromVAR（20, 21）使用的JASPAR数据库中。根据转录因子在发育脊髓图谱中的谱系特异性和HPA（32）中的表达，将其注释为肌肉或神经类型。

融合阴性RMS类器官模型中PAX3-FOXO1的过表达

PAX3-FOXO1融合基因或tdTomato cDNA被克隆至pLV-EF1a-[cDNA]-PGK-puro载体中（购自VectorBuilder：pLV-EF1a-PAX3FOXO1-PGK-puro（Vector ID: VB220603-1030fex）和pLV-EF1a-tdTomato-PGK-puro（Vector ID: VB900122-1868kvz））。采用标准包装方案在HEK293T细胞（RRID: CVCL_0063）中生产慢病毒。融合阴性RMS模型RMS000OYW（类器官1）和RMS444（类器官2）已按照先前描述建立和培养（31）。对于慢病毒转导，将融合阴性RMS细胞接种于六孔板中，并在Polybrene存在下感染pLV-EF1a-PAX3FOXO1-PGK-puro或pLV-EF1a-tdTomato-PGK-puro慢病毒（34）。经过抗生素筛选后，细胞在选择后培养17至24天，收获并进行活冻保存，以供下游单细胞分析。

从类器官融合实验中推导融合基因模块

由于类器官单细胞数据中细胞数量较多且信号清晰，我们能够进行伪批量差异表达分析来推导融合模块。首先，只有当细胞被诱导产生融合基因，且对PAX3:FOXO1的至少两个下游靶标（KCNN3、MCAM、MYOD1、GREM1、FGFR4和MET；参考文献35）具有非零表达时，才将其视为融合阳性细胞。对于对照组样本中的细胞，若其对上述六个靶标均无表达，则视为融合阴性细胞。通过仅保留总计数少于50,000的细胞来确保去除双细胞。对于细胞数超过2,000的样本，我们执行了k-means聚类（k = 3）以获得较小的伪批量样本。将每个样本中的所有细胞汇总以获得伪批量谱，并使用edgeR（v3.42.4；参考文献25）进行差异表达分析。我们去除了线粒体基因，并保留在至少10%的样本中具有logCPM≥0.5的基因。应用拟似然框架来鉴定对照组与融合阳性细胞之间的差异表达基因，同时考虑类器官的影响。采用Benjamini-Hochberg P值校正和FDR阈值0.05确定显著基因。

使用Xenium进行原位基因表达谱分析的样本处理

新鲜冷冻组织样本嵌入OCT（Tissue-Tek OCT Compound, 25608-930）中，并使用Leica CM1950冰冻切片机进行冷冻切片。将10微米切片贴片至Xenium载玻片上（10x Genomics, PN 3000941），并按10x Genomics切片方案（CG000579）储存于-80°C。在探针杂交前，组织切片经解冻、甲醛固定，并用70%甲醇（10x Genomics方案CG000581）透化，以允许探针渗透同时保持组织形态。将Xenium 5K基因表达Panel（PN-1000724）应用于组织切片，使用带有96孔板模块和Xenium Prime适配器的Analytik Jena Biometra TAdvanced 96 SG热循环仪过夜孵育（16-24小时）。杂交步骤按照10x Genomics Xenium方案（CG000760）进行，并使用10x Genomics Xenium Prime样本制备试剂盒（PN-1000720），使特异性发卡探针与RNA靶标结合。杂交后，信号经连接步骤并通过滚环扩增进行扩增，生成用于Xenium分析仪成像的标记产物。扩增完成后，将切片与Xenium细胞分割染色试剂（PN-1000661）在4°C下过夜孵育（16-24小时）。包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色以可视化细胞核并辅助细胞分割。扩增信号使用Xenium分析仪系统（RRID: SCR_023910）通过高分辨率荧光成像进行检测。进行多轮成像以解码条形码探针，捕获组织切片的空间解析转录组数据。运行完成后，样本置于新鲜PBS-T中，直至进行Xenium后染色[苏木精和伊红（H&E）染色]。

Xenium质量控制与数据处理

Xenium空间转录组数据使用Squidpy（36）和自定义Python工作流进行处理和质量控制。数据按每个样本为单位，使用样本级质量控制阈值进行过滤。分别计算每个样本的"total_counts"和"n_genes_by_counts"的中位数和中位绝对偏差（MAD）。"total counts"的下限阈值设定为10或样本特异性中位数减三个MAD，取两者中较大者。检测基因数的单独阈值类似地计算为样本特异性中位数减三个MAD。随后，从每个样本中去除在少于5个细胞中表达的基因。细胞进一步过滤，仅保留检测基因数大于计算阈值的细胞以及恰好被注释为具有一个细胞核的细胞。过滤后，使用样本标识作为批次键将所有样本连接为一个统一的AnnData对象，批次类别设置为样本名称。所得过滤数据集用于下游分析。使用PCA和UMAP进行降维，随后使用Scanpy进行Leiden聚类。应用基因签名评分来识别髓样、血管、细胞外基质相关和淋巴样群体。基于Leiden聚类身份和基因表达模式的下游解读鉴定疑似癌症聚类。为定义Xenium癌细胞，细胞必须表达经典成肌标记物MYOD1或RYR1。使用与高风险签名相关的基因模块通过Scanpy的score_genes函数对细胞进行评分。UMAP嵌入图按样本和自定义结果组进行可视化和注释。使用Seaborn（RRID: SCR_018132）跨样本组生成结果和高得分数的箱线图。

空间邻域富集与自相关指标计算

使用Squidpy包（36）进行空间邻域分析。使用Delaunay三角剖分方法构建空间邻域图。基于Leiden聚类计算中心性评分。为减少计算负担，数据集被下采样至80%的细胞。然后在下采样数据上进行邻域富集分析，以评估聚类间空间共现。为评估空间基因表达模式，使用各100次置换计算Moran I和Geary C统计量。鉴定出表现出显著空间自相关的基因（Moran I >0.1且FDR校正P < 0.05）。

细胞表面靶标的鉴定

我们计算了各预定义组中表达每个基因的细胞比例，将表达定义为任何大于零的值。对于每组，通过将表达细胞数除以该组总细胞数来计算每个基因的表达细胞百分比。鉴定出在我们RMS图谱中的基质和免疫细胞中表达比例低于10%的基因，以排除在正常非恶性群体中广泛表达的基因。为富集基因的攻击性肿瘤特征，选择在融合阳性高风险（融合阳性HR）和融合阴性高风险（融合阴性HR）组中超过10%的细胞中表达的基因。在任一高风险基因型中超过25%的细胞中表达的基因也予以考虑。这些阈值旨在识别在高风险RMS亚型中持续活跃的基因。根据差异表达分析得出的检验统计量，选择高风险RMS（如融合阳性和致死性融合阴性）中上调的差异表达基因。保留检验分数大于50且log倍数变化（FC）为正的基因，表明具有强统计学支持且在查询组中表达更高。我们将指定的"查询"组与"参考"组或所有其他组的组合进行比较。细胞相应地被分配到查询组或参考组。使用Scanpy的rank_genes_groups函数中实现的Wilcoxon秩和检验进行差异表达统计检验。分析生成的统计量包括基因排名分数、log FC以及原始和校正后的P值。然后基因主要按校正P值和log FC进行排名，以识别最显著差异表达基因。

胎儿期靶标——在胎儿发育期间正常表达但在健康成人组织中大部分沉默并在癌症中重新表达的基因或蛋白质——通过评估来自人类细胞图谱（27）的胎儿肌肉数据中的候选基因来鉴定。鉴定出在来自胎儿组织图谱的胎儿肌肉细胞中超过5%的细胞中表达的基因。然后将候选基因与基因型-组织表达（GTEx）数据库（37）进行交叉引用。从GTEx v10 RNA-seq数据集获取基因水平的读计数，并使用edgeR包（25）进行处理。使用截尾均值M值方法计算归一化因子。计算所有基因的logCPM并在组织间取平均值。根据平均logCPM值将表达水平分为五个区间：极低（≤0）、很低（>0且≤1）、低（>1且≤3）、中等（>3且≤4）和高（>4）。记录每个基因落入各表达类别的组织数量和身份。此外，按基因计算logCPM>1的组织比例，以辅助优先级排序。由于细胞表面蛋白对CAR-T细胞或抗体疗法具有可及性，可促进快速临床转化，因此优先选择细胞表面蛋白。通过整合多个精选数据库鉴定细胞表面蛋白候选者。首先处理来自HPA的亚细胞定位数据，选择"主要位置"字段中具有膜相关术语的基因。使用goatools库（RRID: SCR_025305）解析GO数据库，提取GO术语的术语名称和证据代码。从关联文件中检索标注有GO术语细胞表面（GO:0009986）和质膜（GO:0005886）的基因。仅保留由强实验证据支持的GO注释（如EXP、IDA、IPI、IMP、IGI和IEP），并使用综合UniProt ID映射文件将UniProt标识符（RRID: SCR_002380）映射为基因名称。此外，从CellPhoneDB资源（38）中提取受体蛋白。选择标注为受体的蛋白，并获取相应的基因名称。最终候选细胞表面基因列表通过合并HPA膜相关数据集、基于GO的注释和CellPhoneDB受体蛋白的基因编译而成。已知的药物-靶标关联从Open Targets平台（RRID: SCR_02170）获取，通过读取对应于"known_drug"数据集不同分区的两个Parquet文件获得。对于每个匹配的基因，提取并存储所有关联的药物类型和药物名称。Open Targets中的"命中"被视为支持证据，将基因或蛋白与疾病通路联系起来，从而增强其药物开发的候选资格。Open Targets中的某些药物被识别为不适合重定位使用；然而，它们有助于说明其各自靶标的可药性。

细胞表面靶标的蛋白质组学验证

来自10例RMS病例的福尔马林固定石蜡包埋组织块切成3微米切片，在Leica Bond平台（RRID: SCR_025548）上进行免疫组化染色。H&E染色和肌生成素染色作为参考检测。

抗体选择基于实际可用性和既往验证经验，包括 FGFR4（Santa Cruz Biotechnology，SC-136988，A-10 克隆，单克隆，批号 J1123，稀释比 1:75）和 CDH15（Invitrogen，PA5-11489，多克隆，批号 80052356，稀释比 1:75，RRID: AB_2260299）。染色采用 Leica Bond IHC F 方案，使用 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）增强剂，对 CDH15 额外加入蛋白质封闭步骤。对染色结果进行定性评估，观察肿瘤细胞阳性的范围和模式。

胎儿型乙酰胆碱受体表达的流式细胞术检测

RMS 细胞系 RH30（RRID: CVCL_0041）和 RH41（RRID: CVCL_2176）购自 DSMZ，RD（RRID: CVCL_1649）、TE381.T（RRID: CVCL_1751）和 TE441.T（RRID: CVCL_1754）购自 ATCC。除供应商提供的分析证书外，未进行额外的细胞鉴证。购买时为每条细胞系建立了主细胞库，所有细胞库均未检测到支原体污染，本研究中使用的实验样本均来源于这些主细胞库的等分样品。经离散的 RMS 肿瘤组织在 scRNA-seq 样本处理过程中采集，在材料充足的情况下也用于流式细胞术分析。流式细胞术中，使用 MIH42 抗体（BioLegend，RRID: AB_10717510）对 B7-H3 进行染色。含 γ 亚基（由 CHRNG 编码）的胎儿型乙酰胆碱受体亚型的检测使用 mAb131（39）进行，该抗体通过将编码抗体重链和轻链可变区的质粒转染 293T 细胞获得。如文中所述，mAb131 可直接以培养上清形式使用，也可经 Amicon Ultra-15 离心滤器（100 kDa 分子量截留；Merck Millipore）浓缩后，使用 rProtein A GraviTrap 系统（GE Healthcare）和抗体缓冲液试剂盒（Cytiva）进行纯化。抗体标记后的细胞使用 LSR II 流式细胞仪（RRID: SCR_002159）进行分析，软件为 FACSDiva v6.0（RRID: SCR_001456），数据使用 FlowJo v10.8（BD Biosciences，RRID: SCR_008520）进行处理。

**结果**

**发现队列和扩展队列概述**

我们组建了一个包含 16 例 RMS 儿童患者的发现队列，在融合状态、组织学亚型、分期和原发肿瘤解剖部位等方面均能代表该疾病的整体谱（补充表 S1）。该队列中存活儿童的随访时间中位数为 44 个月。以往该领域的研究多依赖冷冻组织或低通量单细胞方法，而本研究从每个肿瘤获取新鲜组织，生成了高通量单细胞 mRNA 数据（图 1A）。作为对比，我们在发现队列中纳入了 2 例尤文肉瘤患儿。为进行验证，我们组建了一个包含 24 例儿童 27 份历史存档样本（新鲜冷冻组织）的扩展队列，通过多组学单核 RNA 测序和 ATAC 测序进行研究。本研究中纳入 1 例促结缔组织增生性小圆细胞瘤（DSRCT）和 2 例骨肉瘤作为对比、归一化参照以及提供不预期出现肌肉信号的基线肉瘤表达谱。此外，我们还对 9 份样本采用 Xenium 技术（单细胞分辨率）获取了高分辨率空间 mRNA 读出数据。在可行条件下，我们使用全基因组测序（WGS）和批量 RNA 测序对肿瘤进行了表征。图 1B 总结了本研究中主要 RMS 样本及所用检测方法，详细信息见补充表 S1。

图 1。发现队列和扩展队列中 RMS 的多组学分析谱与临床特征。A，既往已发表的原发 RMS 单细胞分析总结。本研究（蓝色高亮）独特地对新鲜组织进行了高通量单细胞转录组分析，该方法在最大限度减少冷冻所致伪影的同时保留了基因表达的天然状态。样本数量仅包括含有 RMS 细胞的样本。B，热图显示发现队列中各患者应用的测序方法。患者按临床类别分组：融合阳性肺泡型 RMS（棕色）、融合阴性且预后不良者（红色）和融合阴性且存活者（紫色）。每列代表一名患者。数据显示是否进行了单细胞 RNA 测序、WGS 和 RNA 测序。C，融合阴性 RMS 且死于该病的患者 H&E 染色肿瘤切片。这些病例突出了组织学多样性和侵袭性临床行为，尽管缺乏特征性基因融合。

**融合阴性致死性肿瘤的患儿**

发现队列包含 4 例融合阳性致死性病例和 12 例融合阴性 RMS 患儿。在这 12 例患儿中，有 4 例死于非肺泡型局限性肿瘤的患儿（遗传特征详见补充表 S1）：2 例肿瘤携带经典 MYOD1 突变的患儿，该变异被认为与不良预后相关；1 例胚胎型肿瘤患儿，其重排断点位于 FOXO3 基因内（而非 FOXO1），无融合伙伴；1 例局限性 RMS 患儿，携带 BRD4-NOTCH3 基因融合，为框内融合，这是一种罕见变异，已在少数 RMS 肿瘤中描述（40）。按照欧洲临床实践，这 4 例患儿均不被认为具有临床可操作的分子高危特征（图 1C）。基于融合状态和预后结果，我们将发现队列分为三组：融合阴性致死性疾病患儿（n = 4）、融合阳性疾病患儿（n = 4）以及融合阴性但仍存活的患儿（n = 8）。我们在手术切除后 24 小时内处理发现队列的新鲜组织样本，采用标准流程生成单细胞转录组数据（详见"材料与方法"部分）。我们根据经典标记物（补充图 S1A）和肿瘤特异性拷贝数变化证据（补充图 S1B 和 S1C；参考文献 41）对细胞进行注释。据此，我们鉴定出 70,600 个 RMS 肿瘤细胞（每例中位数 2,602 个）和 44,098 个非肿瘤细胞（每例中位数 683 个；图 2A）。

图 2。融合阳性和致死性融合阴性细胞趋同于高危转录组。A，发现队列所有患者 117,791 个细胞的 UMAP 图。点按恶性细胞类型着色，正常细胞类型聚簇以标签标注。包括 4 例融合阳性患者（棕色）、12 例融合阴性患者（红色和紫色）和 2 例尤文肉瘤患者（黄色）的细胞。B，热图显示全转录组水平上聚合的患者肿瘤细胞轮廓的层次聚类。层次聚类基于成对 Spearman 相关。C，热图显示每位患者各基因模块的平均评分，包括 Danielli 等人推导的"肌肉谱系"模块（上）和每个间充质模块（中）。热图下方显示每位患者的趋同细胞比例（下）。趋同细胞定义为趋同指标大于零（见"材料与方法"）。评分已经过缩放，间充质模块详见补充表 S2。文字注释说明趋同指标的计算方式为每个细胞的肌肉评分与非肌肉间充质评分的比值取对数。D，胎儿结缔组织图谱 119,714 个细胞的 UMAP 图，仅包含趋同指标中所涉及的细胞类型（骨皮质、软骨肥大、软骨衬里、肌腱和纤维）。点按趋同指标着色，以呈现指标评分范围。E，与（A）相同的 UMAP，但在各恶性细胞组中分别按趋同指标着色：来自融合阴性致死病例的 RMS 细胞、来自融合阳性病例的 RMS 细胞或来自融合阴性病例的 RMS 细胞。F，评分景观图显示肌肉谱系评分与非肌肉谱系综合评分（软骨衬里、纤维、肌腱、骨皮质或软骨肥大）的对比关系，按患者平均后着色：融合阳性 RMS（棕色）、致死性融合阴性 RMS（红色）、融合阴性 RMS（紫色）或尤文肉瘤（黄色）。蜂窝状背景代表用于推导模块的胎儿图谱中肌肉谱系（灰色）或非肌肉间充质谱系（蓝色）的评分。所有评分均经过缩放。文字注释说明趋同指标的计算方式为每个细胞的肌肉评分与非肌肉间充质评分的比值取对数，高危转录组的推导基于"高危"聚簇（融合阳性和致死性融合阴性 RMS 细胞，排除融合阴性肺泡型病例）与融合阴性 RMS 细胞的比较（见"材料与方法"）。

**高危肿瘤中的细胞趋同于共同的转录组**

首先，我们对肿瘤细胞进行了常规层次聚类分析。该分析重现了 RMS 按融合状态分组的经典分离模式（6）：融合阳性肿瘤形成一个支系，而融合阴性 RMS（包括致死性肿瘤）形成另一个支系（图 2B）。一例罕见的融合阴性肺泡型 RMS 在融合阳性肿瘤支系（均为肺泡型）中形成了一个独立亚群。类似地，当我们使用近期发表的、基于 RMS 单细胞转录组推导的肌肉基因签名（14）评估肌肉分化时，肿瘤主要按融合状态分离，而非按疾病预后分离（图 2C）。然而，在评估源自人类胎儿结缔组织的分化信号（27–29）时，致死性融合阴性肿瘤反而与融合阳性癌症趋同。

鉴于 RMS 细胞源自结缔组织，我们通过识别基因列表（“模块”）评估了癌细胞表现出人类胎儿肌肉、肌腱、纤维组织、衬里软骨、肥大软骨或皮质骨信号的程度，这些模块在人类胎儿结缔组织单细胞转录组图谱中定义了每个谱系（n = 249,151 个细胞；补充表 S2）。我们如预期地发现，融合阳性肿瘤表现出强烈的肌肉分化，而其他间充质谱系的信号减少（图 2C）。另一方面，存活的儿童融合阴性肿瘤更接近非肌肉间充质谱系，除了肺泡组织学的融合阴性肿瘤。致死性融合阴性肿瘤，像融合阳性病例一样，显示出强烈的肌肉信号。接下来，我们通过根据细胞分化（肌肉与其他聚合分化信号的比率）对单个细胞进行评分，量化了每个肿瘤中肌肉与非肌肉间充质分化的关系，我们将其称为“汇聚指标”（图 2D 和 E）。该指标反映了尽管存在不同的潜在遗传改变，致死性结果肿瘤向具有减少结缔组织信号的类肌肉转录组的汇聚。我们发现，在单细胞分辨率下，致死性融合阴性肿瘤再次类似于融合阳性肿瘤。高比例的细胞表现出增加的汇聚指标，我们将其称为“汇聚”状态 [图 2C（底部）；P = 3.11 × 10?4；双侧 Mann-Whitney U 检验]。相比之下，在非致死性结果的融合阴性肿瘤中，细胞表现出多样化的分化谱系（“多样化”状态）。因此，致死性融合阴性、非肺泡型肿瘤并不类似预后良好的胚胎瘤，反而与融合阳性肿瘤具有惊人的相似性。最后，我们根据分化信号将肿瘤样本投影到胎儿正常细胞的二维地图上（由蜂窝状背景表示），使我们能够在一个定义的间充质空间内可视化肿瘤与胎儿细胞类型的相似性（图 2F）。该分析根据结局、融合状态和组织学分拣了肿瘤：一个簇由预后良好的融合阴性肿瘤组成。在另一个簇中，致死性融合阴性肿瘤和融合阳性肿瘤（以及一例肺泡型、融合阴性病例）聚集在一起。相比之下，在此分析中尤文肉瘤细胞缺乏表达信号，这与先前关于尤文肉瘤缺乏谱系特异性间充质分化的报告一致（42）。肿瘤簇之间的转录差异，融合阴性细胞与融合阳性及致死性融合阴性肿瘤细胞（见“材料与方法”），定义了一个“高风险”转录组，即汇聚细胞中上调的基因（n = 89 个基因；补充表 S3）。我们发现即使根据较旧的、非融合基础的评估定义，该评分也与更高的风险类别相关（补充图 S2；参考文献 43）。总之，这些发现表明致死性融合阴性肿瘤更接近 FOXO1 融合阳性 RMS，表明可能存在一种总体的高风险转录组。

在扩展队列和外部数据中的验证

图 3。融合阳性和致死性融合阴性患者中不同模态和队列的汇聚细胞证据。A，扩展队列中所有患者 172,370 个核的 UMAP 表示。点按恶性细胞类型着色，正常细胞类型簇由标签指示。包括来自七名融合阳性患者（棕色）、17 名融合阴性（红色和紫色）、两例骨肉瘤（浅蓝色）、一例纤维组织细胞性小圆细胞肿瘤（深蓝色）和一例孤立性肌纤维瘤（无恶性核）的核。B，“扩展”队列概述，RMS 患者根据是否融合阴性但死于疾病（红色）、融合阳性（棕色）或融合阴性（紫色）进行分组。热图显示每位患者 RMS 核中每个间充质模块的平均得分。热图下方的行指示是否进行了空间转录组学，携带 MYOD1 突变细胞的患者用星号表示。得分已缩放，间充质模块详见补充表 S2。C，箱线图显示融合阳性病例（棕色）、致死性融合阴性病例（红色）和非致死性融合阴性病例（紫色）中 RMS 细胞的每核高风险模块得分。点代表每位患者的平均得分，星号表示患者的细胞为 MYOD1 突变。剔除 RMS 核少于 50 个的患者。D，条形图指示每位患者中转录汇聚细胞的比例，其中汇聚细胞定义为汇聚指标大于零的细胞。条形图按患者是融合阳性（棕色）、融合阴性（紫色）或融合阴性且死于疾病（红色）着色。携带 MYOD1 突变细胞的患者用星号表示。E 和 F，箱线图显示跨两个外部单细胞（10, 13）和两个单核（10, 11）数据集的汇聚指标（E）或高风险模块（F）的每细胞得分。箱线图按样本是来自融合阴性（浅灰色）或融合阳性（棕色）患者着色。点代表每位患者的平均得分，红色星号表示患者的细胞为 MYOD1 突变。G，箱线图显示跨三个外部数据集（6, 30, 31）和我们队列（“本研究”）的批量 RNA 样本中高风险模块的每样本得分。箱线图按样本是来自融合阴性患者（浅灰色）、融合阳性患者（棕色）或携带 MYOD1 突变的患者（红色）着色。每位患者由一个点表示，P 值使用双侧 Wilcoxon 检验计算。

我们使用汇聚指标对每个肿瘤的间充质谱系分化进行评分，并按汇聚核的比例对病例进行排序（图 3C）。该分析证实了我们最初观察到的高风险病例中汇聚细胞比例更高的现象：融合阳性；致死性融合阴性；和 MYOD1 突变（P > 2.7 × 10?5，双侧 Mann-Whitney U 检验）。同样，当我们评估高风险转录组（源自图 2F 高风险簇的基因）的表达时，我们发现致死性融合阴性病例和 MYOD1 突变肿瘤（致死和非致死疾病）中高风险基因的表达显著增加（图 3D；P < 2.2 × 10?16，双侧 Wilcoxon 秩和检验）。接下来，我们检查了已发表的转录组数据 [单细胞（13），单核（10, 11），和批量 mRNA（6）]，源自 RMS 原发肿瘤，作为我们发现的正交验证。尽管这些病例的详细临床结局不可用，但我们可以按融合状态和 MYOD1 突变状态对肿瘤进行细分。如果我们关于高风险 RMS 转录汇聚的命题为真，我们预期预后不良的融合阳性和 MYOD1 突变肿瘤（携带不良结局）将富含高风险细胞的转录特征。首先，我们应用汇聚指标显示，预后不良的融合阳性肿瘤显著比融合阴性肿瘤更汇聚（图 3E；P < 2.2 × 10?16；双侧 Wilcoxon 秩和检验）。然后我们检查每个样本的高风险变化表达，我们将其定义为在高风险 RMS 簇中显示表达频率增加的基因（如图 2F 所示）。我们发现融合阳性肿瘤中高风险 mRNA 水平显著增加（P < 2.2 × 10?16；双侧 Wilcoxon 秩和检验），并且在外部单细胞和单核数据集以及外部批量 mRNA 数据集中 MYOD1 突变肿瘤的表达升高（图 3F 和 G）。总体而言，这些在不同队列中的正交证据证实了我们关于一个涵盖融合阳性和致死性融合阴性肿瘤以及预后不良 MYOD1 突变 RMS 的汇聚高风险转录组的命题。

通过空间转录组学验证

接下来，我们使用 Xenium 空间转录组学，一种单细胞检测，分析 5,000 个转录本，在代表融合阳性肿瘤、致死性融合阴性肿瘤和预后良好融合阴性肿瘤的九个 RMS 标本中验证高风险细胞的转录汇聚。最引人注目的发现之一是单个肿瘤内关键间充质和肌源性谱系标记物的空间特异性表达。使用 Moran I 空间自相关分析，我们在评估的九个病例中的三个中确定了间充质谱系标记物如 COL2A1、COL4A1/2 和 POSTN 的统计显著区域富集，以及成熟骨骼肌标记物包括 RYR1 和 TNNT2 的空间分离表达（图 4A；补充表 S4，Moran I > 0.3 且 FDR 调整 P < 0.05）。所有病例的空间分析可见补充图 S3。这些空间表达模式表明，同一肿瘤内的不同区域表现出不同的肌源性分化阶段，强调了谱系进展中区域组织的转录变异性。此外，高风险转录程序并非随机分布，而是形成空间富集区域，这与肿瘤内协调的高风险微环境一致（补充表 S4）。值得注意的是，我们还检测到肿瘤内嵌套的 T 淋巴细胞密集聚集和免疫激活信号（补充图 S4A）。

图 4。空间转录组剖析确认高风险特征并揭示免疫邻域。A，代表性 H&E 图像展示了一例致死性（红色）和一例存活（紫色）融合阴性病例的组织形态学。比例尺代表 1,000 μm。相应的 Xenium 空间转录组散点图显示基于基因模块评分的细胞水平表达模式。使用空间可变基因定义三个转录组模块：肌肉、间充质和免疫。对细胞分配模块得分并进行空间可视化，以揭示区域转录异质性。Xenium 高风险得分也映射在整个组织上。值得注意的是，融合阴性存活病例显示出明显的局部免疫富集区域（“免疫邻域”）。

图 4. 空间转录组分析证实了高风险特征并揭示了免疫邻域。
A, 代表性的 H&E 图像展示了融合阴性病例中一例致命性（红色）和一例存活（紫色）的组织形态学。比例尺代表 1,000 μm。对应的 Xenium 空间转录组散点图显示了基于基因模块评分的细胞水平表达模式。空间可变基因被用于定义三个转录组模块：肌肉、间充质和免疫。细胞被分配模块评分并在空间上可视化，以揭示区域转录组异质性。Xenium 高风险评分也映射在组织上。值得注意的是，融合阴性存活病例显示出一个突出的局部免疫富集区域（“免疫邻域”）。
B, UMAP 图显示了基于基因表达的单细胞 Xenium 提取细胞的聚类。细胞按临床亚组着色：融合阳性、融合阴性存活和致命性融合阴性。
C, 箱线图显示了融合阴性致命性和融合阴性存活病例中单个细胞的 Xenium 高风险评分分布。每个箱体代表四分位距（IQR；25th–75th 百分位数），箱体内的水平线表示中位数，须延伸至 1.5 倍 IQR 或该范围内的最极端数据点。使用双侧 Mann-Whitney U 检验比较组间差异；观察到模块评分分布存在显著差异。

为了探究横纹肌肉瘤（RMS）中转录收敛的证据，我们将单个转录本映射到空间分辨的细胞，进行聚类，并相应地注释细胞类型（图 4B；见材料与方法）。然后，我们将图 2 中衍生的“高风险”评分应用于单个细胞，基于 Xenium 5K 面板中代表的 89 基因特征中的 30 个基因的表达进行评分。这使得我们能够在肿瘤架构中空间定位高风险转录程序。总体而言，我们发现致命性融合阴性和融合阳性肿瘤中的细胞表现出显著更高的高风险评分，与来自融合阴性存活者的细胞相比，这与我们之前的单细胞、多组学和 bulk RNA-seq 分析一致（图 4C；补充图 S4B，双侧 Mann-Whitney U 检验，P < 2.2 × 10?16）。将高风险信号分解为高风险阳性细胞的比例及其每细胞表达强度，揭示这种差异主要由高风险阳性肿瘤细胞比例的增加驱动，而每细胞表达强度的差异较为温和（补充图 S4C）。这种空间验证强化了高风险转录程序的稳健性，并揭示了其在特定肿瘤壁龛内的定位。

收敛性高风险转录组的性质
我们使用不同分子实验方法和不同队列的分析显示，某些患有致命性融合阴性疾病的儿童肿瘤在转录上与融合阳性肿瘤收敛。因此，可能存在一种可能性，即致命性融合阴性细胞假设了融合阳性癌细胞状态，这两组肿瘤中成熟肌肉信号的强表达可能暗示了这一点。或者，收敛性高风险转录组可能代表超出 FOXO1 融合转录组的不同或附加特征。我们通过比较 FOXO1 融合的转录效应与融合阴性高风险转录组来解决这个问题。首先，我们从两个源于胚胎性融合阴性肿瘤的 RMS 肿瘤球模型（31）中提炼出 FOXO1 融合转录组。我们用递送 FOXO1 融合构建体的载体对融合阴性肿瘤球培养物进行慢病毒转导，并通过单细胞 mRNA 测序比较转化后现融合阳性的细胞与用表达对照编码序列（CDS）的载体转导的培养物来源细胞（见材料与方法；图 5A）。该实验证实基因融合能够诱导收敛的细胞状态（图 5B；P < 2.2 × 10?16，双侧 Wilcoxon 秩和检验）。接下来，我们评估基因融合的下游转录组是否完全解释了转录收敛。为此，我们将体外衍生的 FOXO1 转录组与从发现队列定义的高风险转录组进行比较（高风险簇中升高的基因与预后良好的融合阴性细胞相比；图 2F）。该分析显示，高风险肿瘤（致命性融合阴性和 MYOD1 突变）的收敛涵盖了 FOXO1 基因融合诱导的直接转录变化（补充表 S5）以及融合未解释的额外 mRNA 变化成分（图 5C）。即使我们使用以前发表的 FOXO1 融合基因特征评分（44），融合的转录组效应也未能完全捕获高风险肿瘤的收敛（补充图 S5）。

图 5. 收敛细胞的表征和功能验证。
A, 示意图说明了 RMS 肿瘤球扰动模型实验工作流程。两条源于胚胎性融合阴性肿瘤的 RMS 肿瘤球系（RMS000OYW 和 RMS444）经实验诱导 PAX3-FOXO1 融合基因，并接受 scRNA-seq 分析。文本注释说明，我们根据诱导融合基因（棕色）的细胞与对照融合阴性 RMS 细胞（浅灰色）相比上调的内容，定义 FOXO1 融合转录组（或模块）。BioRender 用于生成此图的部分组件。
B, 箱线图显示了两个肿瘤球模型（见材料与方法）中融合阳性（棕色）和融合阴性（浅灰色）细胞的收敛指标。
C, 散点图显示了扩展队列中每位患者 RMS 细胞平均的高风险模块（补充表 S3）评分与融合模块（补充表 S5）评分，并按患者的肿瘤是融合阳性（棕色）、融合阴性（紫色）还是融合阴性且死于疾病（红色）进行着色。如果患者携带 MYOD1 突变细胞，点形状为星形。高风险模块如图 2 定义，融合模块源自 (A) 中的融合实验（见材料与方法）。
D, 首先，示意图说明了扩展队列中 snATAC-seq 数据的分析工作流程。我们使用数据的基因表达成分获得收敛细胞和多样化细胞之间差异表达基因。然后我们将差异表达基因子集化至转录因子（TFs），并计算每细胞评分以评估这些 TFs 基序的染色质可及性。BioRender 用于生成此示意图的部分组件。面板下半部分是一个散点图，总结了收敛细胞和多样化细胞之间差异基因表达（x 轴）和 TF 基序可及性差异（y 轴），其中每个点代表一个 TF。如果点在收敛细胞（红色）或多样化细胞（紫色）中显著差异表达则着色，若不显著则保持灰色。在收敛细胞中上调的 TF 具有正 log 倍数变化。y 轴显示收敛细胞中的平均 chromVAR 评分减去多样化细胞中的平均 chromVAR 评分（见材料与方法）。如果 TF 名称被注释为与神经谱系相关，则颜色为红色。
E, 箱线图显示了收敛 TF 和多样化 TF 的平均 TF 基序可及性差异（即收敛 TF 平均 ? 多样化 TF 平均）在正常细胞（灰色）、融合阴性肿瘤中的多样化细胞（紫色）以及融合阳性（红色）和致命性融合阴性肿瘤中的收敛细胞（棕色）之间的差异。
F, 覆盖轨迹显示了致命性融合阴性病例（红色）、融合阳性核（棕色）、多样化融合阴性核（紫色）和非恶性核（灰色）在 MYOD1 位点的染色质可及性。
G, 来自人类胎儿脊柱发育图谱的 174,077 个细胞的 UMAP，按作者提供的主要细胞类型（左）、收敛 TF 评分（中）、多样化 TF 评分（右）着色。TF 评分在 scanpy 中计算，代表由 (D) 中分析定义的 TF 的聚合评分。P 值使用双侧 Wilcoxon 秩和检验计算。A, 由 BioRender 创建。Anderson, N. (2026) https://BioRender.com/h758tn5; D, 由 BioRender 创建。Anderson, N. (2026) https://BioRender.com/aw07wgo.

为了定性注释高风险转录组，我们部署了另一种正交实验，即单核 ATAC 测序，并将其应用于扩展队列。为了定义在收敛核中上调的转录因子，我们在高风险收敛核和预后良好的儿童多样化核之间进行了差异基因表达分析（图 5D）。然后我们使用 chromVAR（20）量化这些差异表达转录因子的可及性，这是一种通过根据转录因子结合基序处的染色质可及性为细胞评分来推断转录因子活性的计算框架（补充表 S6）。我们发现可及性和表达在很大程度上是一致的，表明结合位点更可及的转录因子也被表达且很可能活跃（图 5D 和 E）。检查在收敛细胞中活性更高的转录因子的身份，我们发现已知的肌肉谱系转录因子，如 MYOD1（图 5F）和 MYOG，以及其他具有神经谱系特征（例如 OLIG2、CUX2、DMRTA2 和 MNX1）的转录因子（补充图 S6 和 S7）。

肌肉和神经标志物在细胞和细胞核中共现，表明这些分化状态普遍存在于同一细胞中，而非主要代表不同的细胞群体（补充图S7A和S7B）。随后，我们尝试使用独立的胎儿参考数据集（n = 174,077个细胞；参考文献45）来阐释这些转录状态。重要的是，该参考数据集与用于推导收敛性指标的参考数据集完全不同（图2），确保我们的分析不具有循环性。我们用收敛细胞的转录因子（收敛性转录因子评分）和具有多样分化特征的细胞的转录因子（多样性转录因子评分）对正常胎儿细胞进行评分，发现收敛性转录因子主要特异地表达于肌肉和神经谱系（图5G；补充图S7C和S7D；补充表S6）。为进一步评估收敛性细胞状态所涵盖的神经基因表达程度，我们检查了高风险转录组中的每个基因，发现除与肌肉发育相关的基因（约23%）外，至少20%的基因定义了神经谱系或与神经相关，包括MYCN和NOS1（补充表S3）。然而，对高风险转录组进行的GO富集分析表明，该细胞状态中的主要信号是肌肉，而神经基因表达仅为一小部分成分（补充图S8A）。Danielli及其同事界定的分化和神经元细胞群体中高风险评分表达的增加进一步支持了这一结论（补充图S8B；参考文献14）。我们进一步将高风险转录组与文献中已有的基因特征进行比较（补充表S7；参考文献11, 12）。没有任何重叠具有统计学显著性，包括融合阳性细胞中描述的类神经元特征，这表明高风险转录组反映了一种独特的状态，统一了融合阳性和致死性融合阴性肿瘤。这些发现突显了高风险收敛性细胞状态的复杂性和重叠性，这可能有助于解释这些癌症中观察到的侵袭性行为。高风险细胞的免疫治疗独特靶点

随着免疫治疗作为RMS治疗策略正在积极开发，我们接下来调查致死性融合阴性和融合阳性RMS是否具有可治疗性靶向的重叠或独特分子特征。在此背景下，胎儿发育抗原尤为引人关注，其生理性表达仅限于胎儿期。我们开发了一套基于此前已发表方法的靶点发现分析框架（图6A；见材料与方法；参考文献46）。简言之，我们进行了一项广泛分析以鉴定高风险RMS细胞特异的转录本，然后搜索在大多数出生后组织中沉默的胎儿转录本，使其成为靶向治疗的理想候选者。该鉴定方法确定了多种潜在靶点，我们根据其生物学相关性、可成药性和作为治疗靶点的潜力（定义见图6B）将其分为不同的优先级层级（完整靶点列表见补充表S8）。我们鉴定出了RMS中广泛研究的靶点，包括GPC3（47）和FGFR4（48），我们发现它们分别优先在非致死性和致死性细胞中表达。值得注意的是，我们的无偏靶点鉴定揭示了神经基因（如GABRB3和KCNH2），它们在融合阳性和致死性融合阴性疾病中特别升高，进一步证实了收敛性高风险RMS转录组的神经成分。我们评估了这些潜在靶点在正常出生后组织中的表达［GTEx数据（37）］，结果表明其具有良好的治疗特征，可能反映了有限的脱靶效应（图6C；补充图S9）。图6. 高风险RMS治疗靶点的优先级排序。A，流程图概述了从单细胞RNA测序数据中鉴定潜在治疗靶点的分析工作流程。该流程整合了转录组谱分析、组织特异性过滤和可成药性注释，以根据预定义标准将候选基因系统性地分层。B，热图显示了各样本中表达候选基因的细胞比例，分为三个层级：0级，已知RMS靶点；1级，在RMS组织中高度且选择性表达、也存在于胎儿肌肉中且预测位于细胞表面的基因；2级，满足1级中任一条件的基因。在1级和2级中，与Open Targets平台条目重叠的基因被进一步优先考虑，表明已有可成药性证据。基因按融合阴性致死组中表达细胞的比例排序，突显了在侵袭性疾病中富集的潜在靶点。C，热图展示了GTEx数据库中多种正常人体组织中1级和2级候选基因的平均logCPM表达水平。表达值被分为五个离散区间：极低（≤0）、非常低（>0至≤1）、低（>1至≤3）、中等（>3至≤4）和高（>4）。基因和组织均进行了层次聚类。在正常组织中表达高度受限的基因形成一个独特的分支，强调了其潜在的治疗选择性和最小化预期脱靶效应的潜力。D，IHC验证代表性RMS亚型中候选细胞表面靶点。三个原发性RMS病例中CDH15和FGFR4的代表性IHC染色，同时展示myogenin（MYOG）和H&E染色作为组织学参考。病例包括一个融合阳性肿瘤、一个致死性融合阴性肿瘤和一个非致死性融合阴性肿瘤。这些图像展示了候选细胞表面标志物在临床不同RMS组中肿瘤细胞染色的范围和模式。图6. 高风险RMS治疗靶点的优先级排序。A，流程图概述了从单细胞RNA测序数据中鉴定潜在治疗靶点的分析工作流程。该流程整合了转录组谱分析、组织特异性过滤和可成药性注释，以根据预定义标准将候选基因系统性地分层。B，热图显示了各样本中表达候选基因的细胞比例，分为三个层级：0级，已知RMS靶点；1级，在RMS组织中高度且选择性表达、也存在于胎儿肌肉中且预测位于细胞表面的基因；2级，满足1级中任一条件的基因。在1级和2级中，与Open Targets平台条目重叠的基因被进一步优先考虑，表明已有可成药性证据。基因按融合阴性致死组中表达细胞的比例排序，突显了在侵袭性疾病中富集的潜在靶点。C，热图展示了GTEx数据库中多种正常人体组织中1级和2级候选基因的平均logCPM表达水平。表达值被分为五个离散区间：极低（≤0）、非常低（>0至≤1）、低（>1至≤3）、中等（>3至≤4）和高（>4）。基因和组织均进行了层次聚类。在正常组织中表达高度受限的基因形成一个独特的分支，强调了其潜在的治疗选择性和最小化预期脱靶效应的潜力。D，IHC验证代表性RMS亚型中候选细胞表面靶点。三个原发性RMS病例中CDH15和FGFR4的代表性IHC染色，同时展示myogenin（MYOG）和H&E染色作为组织学参考。病例包括一个融合阳性肿瘤、一个致死性融合阴性肿瘤和一个非致死性融合阴性肿瘤。这些图像展示了候选细胞表面标志物在临床不同RMS组中肿瘤细胞染色的范围和模式。关闭图6。为对单细胞转录组分析鉴定的候选表面靶点进行正交验证，我们通过IHC和流式细胞术评估了RMS中选择的优先抗原。FGFR4作为阳性对照被纳入，因为它此前已被描述为RMS中的免疫治疗靶点（48），而CDH15和胆碱能受体亚基则基于肿瘤限定的发育性表达被优先考虑。对10个RMS标本（6个融合阴性和4个融合阳性）进行的IHC显示，10例中有9例FGFR4染色阳性，9例CDH15染色阳性（图6D）。我们还考虑了胎儿烟碱型乙酰胆碱受体程序，其中由CHRNG编码的γ亚基在出生后骨骼肌中被ε亚基取代，这表明CHRNG表达的持续可能存在癌胎儿和肿瘤选择性特征。尽管由于缺乏合适抗体无法通过IHC可靠评估CHRNG，但流式细胞术在5个RMS细胞系中的4个以及检测到的所有3个原发肿瘤样本中检测到了其表面表达（补充图S10）。总之，这些发现支持了优先靶点在RMS中的蛋白水平表达，并突出了胎儿型乙酰胆碱受体的胎儿异构体CHRNG作为抗原靶向治疗的候选靶点，尽管其表面丰度相对较低，特别是考虑到其发育限定性以及工程化细胞疗法靶向低密度抗原的能力。讨论

RMS可能无法治愈，原因有多种，如诊断时疾病已扩散，或侵袭性癌细胞使得即使局部肿瘤也难以根除。侵袭性癌细胞的主要标志物是FOXO1融合，这在大多数肿瘤中与成熟肌肉细胞状态密切相关。我们检查了融合阴性的致死性肿瘤，发现它们在转录上与融合阳性RMS细胞收敛。这一发现表明，RMS中存在一个总的侵袭性疾病细胞状态，与现有特征的比较表明，该状态尚未被既往研究捕捉到。该状态与FOXO1转录组部分重叠并表现出独特特征，在人类发育意义上代表了一种神经和肌肉的杂交状态。这种杂交身份得到了此前报道的RMS中神经和神经内分泌标志物异常表达的支持（49）。收敛性在很大程度上但不完全由基因融合分子模拟所解释。这表明RMS中的侵袭性行为可能至少部分被更好地理解为止一种转录细胞状态，而非仅作为特定起始基因型的后果。在此框架下，融合阳性疾病和一组临床侵袭性融合阴性肿瘤可能通过不同的上游分子途径达到共同的下游程序。这提供了一种方法来解释为何某些融合阴性肿瘤的行为比传统分子分类所预期的更具侵袭性。我们的发现建立在来自不同队列的多条证据链之上，包括外部数据和多种检测方法的数据。因此，我们识别的信号不太可能由技术或患者偏差驱动。使我们能够发现这一现象的是与临床团队的紧密合作，以准确捕捉疾病表型和患者结局，这指导了我们的分析。然而，患者结局也是我们分析中潜在的混杂因素，因为我们无法排除结局良好的儿童未来复发的可能性。即便如此，鉴于实验规模之大和信号的广泛验证，我们的发现不太可能发生根本性改变。此外，中位随访时间为44个月，考虑到RMS通常在诊断后36个月内复发（50），我们已经给予了足够的时间让大多数复发发生。我们的发现提出的一个关键问题是：什么支撑了这种收敛性高风险细胞状态，该状态除了MYOD1 L122R突变富集外，未与任何组织学模式或体细胞变异相关。该突变已被与RMS的不良结局联系起来，而我们的发现显示MYOD1突变肿瘤与融合阳性RMS之间的转录收敛性令人惊叹。有可能我们在融合阴性致死性疾病中鉴定出的某些驱动（致癌）突变［例如罕见的NOTCH3融合或其他近期描述的基因融合（51, 52）］，随着我们对RMS基因组理解的深入，未来可能被确认为罪魁祸首。相应地，统一致死性疾病的可能是低频高风险体细胞突变，这些突变收敛于一个共同的细胞状态。迄今为止，最大的RMS基因组研究涵盖不超过44个肿瘤（6），而需要对数千个精心注释队列的基因组进行研究才能检验这一假设。或者，高风险细胞状态可能由表观遗传变异或偶然因素驱动。我们认为，除了其生物学意义——提出了一个总的侵袭性疾病癌细胞状态的命题——外，我们的发现还具有潜在的临床意义。通过前瞻性地检查更大队列，可能有可能验证侵袭性疾病的基因特征，用于风险分层。这包括鉴定出看似融合阴性但 nevertheless 携带高风险转录程序的肿瘤，这些肿瘤可能需要更密切的监测或强化治疗。

我们的研究结果优先关注融合阴性离群病例，以供进一步的基因组、表观基因组和功能研究，因为这些肿瘤可能揭示通往相同致死细胞状态的替代路径。重要的是，尽管89基因特征谱可重复性地识别出高危RMS细胞状态，但我们的研究并未提供直接的功能证据表明该程序驱动了侵袭性疾病。因此，我们将该特征谱视为定义了与高危RMS相关的趋同转录状态，而非确立了一种因果机制。类似地，尽管我们的分析确定了与该状态相关的候选抗原，但在靶点发现中对其进行优先排序仍需要进一步验证其在正常组织中的表达，尤其是在儿科背景下。在新兴的癌症细胞图谱的更广泛背景下，我们研究结果的意义在于揭示了一种以mRNA形式存在的癌症细胞状态，这种状态超越了传统的预后边界，即使是在如RMS这样在分子和临床方面都被充分研究的癌症类型中也是如此。我们专注于疾病模式的定量分子分析方法，可能揭示其他癌症类型的类似发现。

数据可用性

发现队列和扩展队列的测序数据（DNA、bulk mRNA、单细胞mRNA和单细胞核mRNA测序）可通过欧洲基因组-表型组档案获取。本研究中产生的数据的登录号及描述信息可在补充表S9中找到。每个单细胞和单细胞核mRNA测序数据集（发现队列和扩展队列）的经处理和原始计数数据均可通过CELLxGENE进行可视化（点击"explore"）和下载（点击"download"）：https://cellxgene.cziscience.com/collections/67d26b1d-2b78-4489-ac5e-0f33909a76cb。Xenium原始数据和经处理数据已上传至Zenodo，可访问：https://zenodo.org/records/16785315（53）。所有其他原始数据均可向通讯作者申请获取。

代码可用性

本文报告的研究结果未使用任何此前未报告过的自定义计算机代码或算法。用于分析数据和生成图形的代码可在Behjati实验室仓库中获取：https://github.com/BehjatiLab/RMS-lethal-sc-convergence

作者利益声明

J.C. Hutchinson报告了来自Cirdan Imaging, Ltd.的非资金支持，该支持在提交工作之外。K. Straathof报告了在研究进行期间获得了UCL的资助。S. Behjati报告了来自Alice's Arc和Wellcome Trust的资助，以及在提交工作之外来自Athernal Bio的个人费用。其他作者未报告任何利益冲突。

作者贡献

H.J. Whitfield：数据整理、正式分析、验证、调查研究、可视化、方法论、撰写——初稿、撰写——审阅和编辑。N.D. Anderson：数据整理、正式分析、监督、验证、调查研究、可视化、方法论、撰写——初稿、撰写——审阅和编辑。C. Burke：正式分析。M.J. Groot Koerkamp：正式分析。C. Parks：数据整理、项目管理。T. Ogbonnah：正式分析。Y. Wood：正式分析。A. Piapi：正式分析。E. Robertson：正式分析。E. Watt：正式分析。A. White：正式分析、验证。S. De Noon：资源、数据整理、正式分析。J. Kennedy：资源、数据整理。R. Nagrecha：资源、数据整理。M.T. Meister：资源、数据整理。E. Aladowicz：正式分析。Y.K.S. Man：正式分析。V. Laspidea：正式分析。M.K. Trinh：正式分析。A. Hodder：正式分析。T. Porter：项目管理。J.E. Lawrence：正式分析。E. Tuck：正式分析。T. Nguyen：监督。A. Kelsey：监督。A.M. Flanagan：资源、监督。R. Hewitt：资源、监督。N. Smeulders：资源、监督。O. Slater：资源、监督。J.C. Hutchinson：资源、监督。N. Sebire：资源、监督。J.M. Shipley：资源、监督。J. Drost：概念构思、资源、监督、资金获取。K. Straathof：概念构思、资源、正式分析、监督、撰写——审阅和编辑。S. Behjati：概念构思、资源、监督、资金获取、撰写——初稿、项目管理、撰写——审阅和编辑。

致谢

本研究中使用的部分样本和数据由儿童癌症与白血病组组织库（现为VIVO生物库的一部分）提供，该库得到癌症研究英国和血液癌症英国的支持，以及由UCL癌症研究所核心经费、癌症研究英国伦敦市中心和NIHR BRC资助的UCL/UCLH癌症生物标志物中心支持的UCL/UCLH健康与疾病研究生物库提供；样本从RNOH卫星HTA许可场所获取。样本在VIVO项目编号23-VIVO-07和23-VIVO-22下释放。本研究由癌症研究英国-儿童癌症英国创新奖（DRCPGM\100075）、NIHR GOSH生物医学研究中心和NIHR剑桥生物医学研究中心（NIHR203312）、癌症研究英国资助的NexTGen癌症重大挑战合作项目（CGCATF-2021/100014）、NCI（CA278730-01）、马克癌症研究基金会以及Alice's Arc共同资助。英国骨骼癌症研究信托（BCRT/5717）提供了资金支持。威康信托提供了额外资金（机构资助：206194、220540/Z/20/A）以及给S. Behjati的个人奖学金（223135/Z/21/Z）。N.D. Anderson获得了欧盟地平线2020研究和创新计划下玛丽·斯克洛多夫斯基-居里奖学金协议的资助（编号885818）。J. Drost获得了欧洲研究委员会（ERC-CoG编号101170012）和儿童癌症-free基金会（KiKa）的资助。A.M. Flanagan得到国家卫生研究学院、UCLH生物医学研究中心和UCL实验癌症中心的支持。文中表达的观点仅代表作者本人，不一定代表NHS、NIHR或卫生部的观点。作者感谢护理患儿的临床团队。作者感谢Alice's Arc的Sara Wakeling对我们的研究结果进行讨论。作者对参与我们研究的儿童及其家人深表感激。请注意，本研究部分由威康信托资助。为了开放获取，作者将对本次提交产生的任何作者接受手稿版本申请CC BY公共版权许可。

注意：本文的补充数据可在《癌症研究》在线版（http://cancerres.aacrjournals.org/）获取。