《Biomolecules》：Dynamic Metabolomic Landscape of the Murine Brain Across Acute to Chronic Stages of Borrelia garinii Infection
编辑推荐：
莱姆神经疏螺旋体病（Lyme neuroborreliosis, LNB）由伽氏疏螺旋体（Borrelia garinii）引起，常导致持续性神经功能缺损，然而早期诊断敏感性不足，且感染脑组织中的时序性代谢变化尚缺乏系统探索。本研究利用80只雌性BALB/c小
莱姆神经疏螺旋体病（Lyme neuroborreliosis, LNB）由伽氏疏螺旋体（Borrelia garinii）引起，常导致持续性神经功能缺损，然而早期诊断敏感性不足，且感染脑组织中的时序性代谢变化尚缺乏系统探索。本研究利用80只雌性BALB/c小鼠建立B. garinii感染模型，分别在急性期（感染后第7天，DPI）、中期（15和21 DPI）和慢性期（30 DPI）收集脑组织，采用非靶向气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）代谢组学技术进行分析。共鉴定出31种差异代谢物，其中急性期以下调代谢物为主，慢性期以上调代谢物占优。12种共同改变的代谢物包括肌酸、赖氨酸和半乳糖衍生物等。KEGG分析显示氨基酸代谢紊乱，尤其是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（ko00290）、精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）以及氨酰基-tRNA生物合成（ko00970）。ROC曲线分析筛选出五种候选生物标志物——羟胺、2,3-二羟基吡啶、半乳糖1、半乳糖2和单硬脂酸甘油酯，具有较高的诊断准确性。本研究提供了B. garinii感染过程中脑组织的全面时序性代谢组学图谱，揭示了时间依赖性的代谢重编程，伴有氨基酸和能量代谢的持续紊乱，并为改善莱姆病中枢神经系统受累的诊断提供了候选生物标志物。
一、研究背景与科学问题
莱姆病（Lyme disease, LD）是由伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi sensu lato）引起的北半球最常见蜱传疾病，仅美国每年估计诊断约47.6万例，欧洲和亚洲亦承受巨大负担。在中国，伽氏疏螺旋体（Borrelia garinii）是优势基因种，东北和西部省份高风险人群血清阳性率超过10%，具有显著公共卫生影响。B. garinii主要分布于中国北方林区，与神经疏螺旋体病密切相关，表现为淋巴细胞性脑膜炎、颅神经炎及其他神经系统症状。研究表明，B. garinii基因组中高表达的BBQ67影响其自身遗传转化，且在脑组织中高丰度表达可能与其嗜神经组织倾向有关。此外，感染过程中B. garinii可差异表达外膜蛋白如OspA、OspC、DbpA/B和Erp以适应蜱与哺乳动物宿主之间的转换并逃避宿主免疫清除。尽管早期感染常表现为游走性红斑，螺旋体可播散至多器官，导致关节炎、心脏炎和神经系统受累等多种临床表现。其中，莱姆神经疏螺旋体病（Lyme neuroborreliosis, LNB）是尤为严重的并发症，B. garinii与脑膜神经根神经炎和脑炎等神经系统表现密切相关。
当前LNB诊断主要依赖间接血清学方法，特别是鞘内抗疏螺旋体抗体合成的检测，结合相符的神经系统症状和脑脊液细胞增多构成欧洲病例定义的基础。然而，鞘内抗体产生可能在感染早期缺如，且治疗后抗体可持续数年，限制了其在评估疾病活动性方面的效用。治疗通常采用10–14天的静脉头孢曲松或口服多西环素，多数患者反应良好。尽管如此，部分患者在适当治疗后仍出现持续性症状，而随机试验一致表明延长抗生素治疗未能带来获益。这些诊断和治疗局限性凸显了深入理解B. garinii感染期间中枢神经系统（central nervous system, CNS）内代谢紊乱的必要性。
尽管血清学诊断取得进展，LNB的准确检测仍面临重大挑战，尤其是在抗体应答常无法检出的早期阶段。现行两级血清学检测在急性感染中灵敏度有限，且无法可靠区分活动性与已消退的疾病。此外，神经疏螺旋体病的病理生理机制仍未完全阐明，特别是伴随CNS感染的代谢紊乱。虽然代谢组学方法在识别早期LD和莱姆病治疗后综合征的诊断生物标志物方面展现出前景，但对疏螺旋体感染期间脑代谢组的全面表征仍然有限。现有研究主要分析了血清和脑脊液，发现了早期疾病中类花生酸、胆汁酸、鞘脂、甘油磷脂和酰基肉碱通路的改变，以及神经疏螺旋体病中色氨酸-犬尿氨酸轴失调和线粒体能量应激标志物。然而，这些全身性和脑脊液谱可能无法完全捕捉脑实质内发生的局部代谢扰动。此外，从急性到慢性感染阶段脑代谢变化的时序动态尚未得到系统表征。
脑是播散性LD的关键靶器官，感染可导致神经炎症、线粒体功能障碍和神经递质代谢改变。先前转录组学分析揭示了早期播散性LD患者中持续的干扰素调节基因表达，而代谢组学研究已在血清和尿液中鉴定出氨基酸和脂质代谢的紊乱。然而，这些全身性谱可能无法完全反映脑实质内的局部代谢扰动。因此，本研究旨在通过系统表征B. garinii感染小鼠模型脑组织的时序代谢景观，填补对LNB发病机制理解的关键空白，并为开发靶向诊断和治疗策略提供基础。
二、主要关键技术方法
研究人员采用以下关键技术方法开展研究：1）动物模型：选用80只SPF级雌性BALB/c小鼠，皮下接种B. garinii SZ菌株悬液建立感染模型，分别于感染后7、15、21和30天收集脑组织，每组10只小鼠，对照组注射等量无菌PBS，所有动物实验经兰州兽医研究所动物伦理委员会批准（许可证号：LVRIAEC2024-06）；2）非靶向代谢组学分析：采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱联用技术（GC-TOF-MS）进行脑组织代谢物检测，使用DB-5MS毛细管柱分离，全扫描模式（m/z 85–600）采集质谱数据；3）数据处理与分析：使用Chroma TOF4.3X软件和LECO-Fiehn Rtx5数据库进行峰提取、基线过滤、峰对齐、解卷积分析和峰鉴定，结合单变量分析（倍数变化FC、t检验p值、变量投影重要性VIP）和多变量分析（主成分分析PCA、正交偏最小二乘判别分析OPLS-DA）筛选差异代谢物，筛选条件为VIP > 1、p < 0.05、FC > 2或< 0.5；4）通路富集与生物标志物分析：利用KEGG数据库和GO数据库进行代谢通路注释和富集分析，采用受试者工作特征曲线（ROC）评估候选代谢物的诊断潜力。
三、研究结果
3.1 代谢物鉴定与离子检测
通过多种方法确认B. garinii SZ菌株成功感染。显微镜下观察到脑组织培养物中存在长度为10–15 μm、呈震颤运动的螺旋体。组织病理学分析一致验证了所有实验组小鼠的螺旋体感染。感染15天后，40只感染小鼠中有8只（20%）出现跛行或后肢拖拽。经过预处理（包括过滤、缺失值插补和标准化），共保留510个脑代谢物相关峰用于分析。多变量统计分析显示清晰的数据质量和组间分离，OPLS-DA模型及其置换检验证实各组间存在明确分离，模型参数稳定，具有良好的拟合度和强预测性能。
3.2 差异代谢物筛选
在脑中共鉴定出31种差异代谢物。急性期（7 DPI）检测到11种代谢物，其中6种下调、5种上调；中期（15 DPI）鉴定出15种代谢物，包括9种下调、6种上调；后期（21–30 DPI）检测到的代谢物数量逐渐减少（21 DPI为11种，30 DPI为9种），上调代谢物数量超过下调代谢物。总体而言，代谢物数量先增后减，早期以下调代谢物为主，后期以上调代谢物为主。进一步鉴定出脑组织在四个时间点共有的12种共同差异代谢物，包括肌酸、2,3-二羟基吡啶、赖氨酸、analyte 975、核糖-5-磷酸2、亚油酸甲酯、单硬脂酸甘油酯、棕榈酸、半乳糖1、羟胺、次黄嘌呤1、半乳糖2。分类分析显示主要类别为“其他”、脂肪酰基类（17%）、苯及其取代衍生物（9%）、碳水化合物及碳水化合物缀合物（8%）、羧酸及其衍生物（8%）。
3.3 差异代谢物功能分析
脑组织差异代谢物的富集分析显示，两个最显著的GO条目为“缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成”和“精氨酸和脯氨酸代谢”。KEGG注释和富集分析表明，“全局和概览图谱”和“氨基酸代谢”途径显著富集。基于富集分类，大多数差异代谢物与代谢途径相关，其次是生物体系统和人类疾病途径。前20条途径中，氨酰基-tRNA生物合成（ko00970）、抗坏血酸和醛酸代谢（ko00053）、蛋白质消化吸收（ko04974）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（ko00290）、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（ko00280）以及氨基酸生物合成（ko01230）优先富集。代谢物与关键KEGG途径的相关性网络分析显示，相关性最高的途径为“蛋白质消化吸收”和“氨酰基-tRNA生物合成”，关键代谢物包括肌醇、赖氨酸和苏氨酸1。进一步分析显示，感染后脑组织中氨基酸和中心碳代谢广泛紊乱，关键途径如精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）、丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢（ko00250）、蛋白质消化吸收（ko04974）和氨酰基-tRNA生物合成（ko00970）在7和15 DPI时表现出多种代谢物（如脯氨酸、赖氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和琥珀酸）的协调下调，仅苏氨酸在21 DPI时上调。
3.4 潜在生物标志物筛选
通过ROC曲线分析，在脑组织中成功鉴定出五种潜在生物标志物：羟胺、2,3-二羟基吡啶、半乳糖1、半乳糖2和单硬脂酸甘油酯。这些分子被确定为具有潜在诊断或研究意义的候选生物标志物，所有标志物的曲线下面积（AUC）均大于0.8，显示出良好的诊断准确性。
四、讨论与结论
本研究应用非靶向GC-TOF-MS代谢组学方法，系统表征了B. garinii感染小鼠脑组织的时序性代谢扰动，重点关注潜在生物标志物和紊乱通路的识别。通过整合急性（7 DPI）、中期（15、21 DPI）和慢性（30 DPI）感染阶段的动态代谢组学图谱，在脑中共鉴定出31种差异代谢物，揭示了宿主代谢的时间依赖性转变。脑组织呈现独特的代谢谱，时序分析显示急性期以下调代谢物为主，而后期（21–30 DPI）上调代谢物更为普遍，表明从早期代谢抑制向慢性感染期间代偿性或适应不良性代谢反应的转变。这一模式与既往报道的B. garinii在小鼠中的感染特征一致，即细菌载量和宿主反应在不同脑区和时间点有所变化。
在脑组织四个时间点共有的12种共同差异代谢物中，肌酸、赖氨酸和半乳糖衍生物尤为突出。肌酸是能量稳态的关键参与者，在15和21 DPI的脑中下调，这与阿尔茨海默病和其他与线粒体功能障碍相关的神经退行性疾病中观察到的水平降低一致。赖氨酸在7和15 DPI的脑中下调，其对蛋白质合成至关重要，且是促进脂肪酸氧化的肉碱的前体，其下调可能导致能量代谢和神经传递的紊乱。与此一致，通路分析发现氨酰基-tRNA生物合成（ko00970）和蛋白质消化吸收（ko04974）显著富集，赖氨酸和苏氨酸成为这些途径中的关键节点。
KEGG富集分析显示，脑中最显著影响的途径包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成（ko00290）、精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）。缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和琥珀酸在7和15 DPI时协调下调，仅苏氨酸在21 DPI时上调，指向动态的途径特异性代谢反应。
ROC曲线分析在脑中鉴定出五种潜在生物标志物：羟胺、2,3-二羟基吡啶、半乳糖1、半乳糖2和单硬脂酸甘油酯，所有标志物的AUC均大于0.8，表明具有较强的诊断潜力。其中，半乳糖衍生物此前已被认为与急性LD中的宿主糖基化变化相关，可能影响免疫球蛋白功能和免疫逃逸。羟胺和2,3-二羟基吡啶在LD中较少报道，但在其他背景下已被认为与氧化应激和神经炎症过程有关。单硬脂酸甘油酯作为一种甘油脂，可能反映脂质代谢紊乱，这已通过脂肪酶活性和膜重塑的改变与疏螺旋体感染相关联。
结论： 总之，本研究提供了B. garinii感染脑组织反应的全面代谢组学表征，揭示了氨基酸和能量代谢的时间依赖性改变，并鉴定出几种具有高诊断潜力的候选生物标志物。研究结果突显了脑作为LD中代谢脆弱器官的地位，并提示蛋白质合成和中心碳代谢的紊乱可能是该病神经系统表现的基础。未来研究应在更大队列中验证这些生物标志物，并探索其在LD发病机制中的机制作用。
