《Molecules》：Volatile Compound Profile as a Biomarker of the Ripening Stage of Cornelian Cherry Fruits
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本研究首次评估了山茱萸（Cornus mas L.，品种‘Bolestraszycki’）果实四个不同成熟阶段——未熟（绿色）、半熟（淡橙色和浅红色）及完全成熟（深红色）——的挥发性化合物（VCs）谱，旨在确定能够描述果实成熟阶段的特异性挥发性标志物。研究人员
本研究首次评估了山茱萸（Cornus mas L.，品种‘Bolestraszycki’）果实四个不同成熟阶段——未熟（绿色）、半熟（淡橙色和浅红色）及完全成熟（深红色）——的挥发性化合物（VCs）谱，旨在确定能够描述果实成熟阶段的特异性挥发性标志物。研究人员采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱/质谱联用（GC/MS）技术研究了香气挥发性化合物的演变过程。醛类和醇类在山茱萸果实挥发性化合物谱中占主导地位，分别占18.2%–54.7%和20.0%–45.9%。成熟过程导致醛类相对含量显著下降（己醛降低7倍），同时醇类含量增加（乙醇、丁醇相对含量升高，并出现己醇）。高含量的己醛、2-己烯醛（E）、戊醇、1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、樟脑、贝壳杉烯、杜松烯、戊烷和二甲基硫醚，以及多种酯类和醇类的缺失，可作为未熟果实的挥发性标志物。相反，高含量的乙醇、丁醇和己醇，以及以乙酸乙酯为主的多种酯类和升高的乙酸含量，则是完全成熟果实的特征。综上所述，特定挥发性化合物的存在或相对含量可作为山茱萸果实成熟阶段的生物标志物。
一、研究背景与意义
山茱萸（Cornus mas L.），又称欧亚山茱萸或梾木，属于山茱萸科（Cornaceae），以其可食用的红紫色椭圆形或梨形果实而闻名。果实通常在完全成熟时采收，表现为深红色果皮、柔软果肉和浓郁香气。山茱萸果实风味独特，呈樱桃样特征，口感或酸或酸甜，取决于品种或基因型。完全成熟的果实广泛用于果酱、果汁、蜜饯、肉酱、蜂蜜酒、果啤、葡萄酒、利口酒、酊剂及混合水果制品等各类产品制备。此外，山茱萸果实还可作为酸奶、冰淇淋、白巧克力及汉堡的功能性添加成分。果实富含有机酸、果胶、维生素C、A、E、B?、B?、多酚、环烯醚萜类等多种营养物质和生物活性化合物。
果实香气是一个受多种途径、反应及大量挥发性有机化合物影响的复杂属性。植物中挥发性物质的生物合成是一个多步骤的动态代谢过程，其中源自不饱和脂肪酸的挥发性化合物通过脂氧合酶（LOX）和β-氧化途径产生。C?醛类、醇类和酯类源自多不饱和脂肪酸（PUFAs），通过LOX途径形成。已有研究表明，果实成熟度显著影响多种果实的挥发性化合物组成和丰度，如桃、香蕉、苹果、草莓、黑莓、刺梨、果冻棕榈、芒果和红灯甜樱桃等。在未熟果实中，C?醛类和醇类是"青绿"果实香气的主要贡献者，但随着果实成熟往往急剧下降；而酯类、内酯类、部分含硫挥发性物质及呋喃酮类则随成熟度增加，成为成熟果实香气的关键贡献者。
然而，尽管对山茱萸果实的组成和营养价值已有广泛研究，但其挥发性化合物组成及其成熟过程中的演变尚未见报道。此前仅有两项相关研究：一项检测了成熟果实经水蒸馏后的挥发性成分及其果肉，另一项分析了以成熟果实制成的自制酒精饮料"Derenja"中的挥发性化合物。因此，本研究旨在表征山茱萸果实四个成熟阶段的挥发性化合物谱，以确定可用于追踪果实成熟阶段的挥发性标志物。
二、研究设计与技术方法
研究人员从波兰博莱斯特拉希策的树木园和自然地理研究所采集山茱萸（品种'Bolestraszycki'）果实，于2024年按四个成熟阶段人工采收：7月21日（绿色果皮、果肉坚实的未熟果实，RS1）、8月11日（淡橙色带红色调、果肉坚实的中间成熟果实，RS2）、9月1日（果皮完全变红、果肉开始软化的果实，RS3）、9月22日（果皮深红色、质地非常柔软、香气增强的完全成熟果实，RS4）。每个阶段采收100个果实，来自五株不同植株的不同部位。
主要技术方法包括：采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱/质谱联用（GC/MS）分析挥发性化合物谱；通过酸碱滴定法测定可滴定酸度（TA）；使用阿贝折光仪测定总可溶性固形物（TSS）含量；采用ABTS•?自由基清除法测定抗氧化活性；使用Folin-Ciocalteu试剂法测定总酚含量（TPC）；利用主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）进行多元统计分析。
三、研究结果
3.1 理化特性和抗氧化性能
可滴定酸度（TA）在山茱萸果实成熟过程中逐渐增加。绿色未熟果实（RS-1）的TA最低，为6.3 g苹果酸（MA）/100 g果实干重（DW），而成熟果实为15.2和13.3 g MA/100 g DW。果实pH值范围为3.13至3.56。总可溶性固形物（TSS）在成熟过程中有所变化，从未熟绿色果实的16.8 °Brix降至RS-2阶段的11.5 °Brix，随后在RS-3阶段略有上升至12.6 °Brix，完全成熟果实（RS-4）达到最高值18.4 °Brix。未熟果实的抗氧化活性（98.1 mM TE/100 g DW）显著高于后期成熟阶段，比完全成熟果实（13.5 mM TE/100 g DW）高7.3倍。总酚含量（TPC）呈现与ABTS•?变化相似的趋势，未熟果实最高为1630 mg GAE/100 g FW，随成熟降至367 mg GAE/100 g FW。
3.2 挥发性化合物谱
GC/MS分析在山茱萸果实顶空中鉴定出49种挥发性化合物，包括醛类（10种）、醇类（10种）、酯类（6种）、酮类（5种）、萜烯类（11种）、烃类（5种）及两种其他化合物。完全成熟果实含有略多的挥发性化合物（46种），未熟和中间阶段分别为39种和44种。
醛类是山茱萸果实中最丰富的挥发性化合物，占总挥发性谱的18.2%至49%。绿色未熟果实（RS-1）和淡橙色中间成熟（RS-2）样品的醛类总相对含量约为后期成熟阶段（RS-3和RS-4）的2倍。己醛、2-己烯醛（E）和壬醛是主要醛类，分别占醛类总相对丰度的25.2%–53.6%、18.4%–19%和10.3%–14.4%。成熟过程中醛类水平趋于下降，主要归因于己醛相对含量降低6倍。
醇类是山茱萸果实挥发性谱中第二大化学组，相对含量为18%至43.5%。完全成熟果实中乙醇（约高15倍）和丁醇（高12倍）的相对含量显著高于未熟果实。成熟样品（RS-3和RS-4）还因存在三种新化合物而与未熟样品区分，其中己醇为主要化合物，丰度为9.5%。戊醇和1-辛烯-3-醇的相对含量在成熟过程中分别下降6倍和4倍。
酯类在山茱萸果实中鉴定出六种（乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸异戊酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯和乙酸己酯），总相对含量（2.7%–23.8%）显著低于醛类和醇类。乙酸乙酯是主要酯类（2%–12.6%），在所有样品中均占主导地位。乙酸丁酯是第二重要的酯类，其相对丰度在成熟过程中增加（0.7%–3.5%）。另外四种酯类仅在后期成熟阶段（RS-3和RS-4）检出。
萜烯类由十二种化合物代表。绿色未熟果实的萜烯类总含量（12.3%）高于完全成熟果实（2.5%）。杜松烯仅在早期成熟阶段（RS-1和RS-2）检出，相对丰度为4.6%至5.3%。贝壳杉烯和樟脑的相对含量随果实成熟显著下降。
五种酮类在早期成熟阶段的相对浓度较高，总酮类相对丰度为3.7%（RS-3）至6.9%（RS-1），以6-甲基-5-庚烯-2-酮为主。烃类相对含量为2.9%至6.3%，随成熟显著下降，戊烷是主要烃类，占烃类的79%–82%。
在其他挥发性物质中，乙酸相对含量随成熟增加（0.5%–3%），可作为果实成熟度的潜在标志物。二甲基硫醚的相对含量为2.2%–4.4%。
3.3 多元统计分析
主成分分析（PCA）显示前两个主成分解释了总方差的93.7%，PC1占84.7%，PC2占9.0%。成熟阶段在PCA空间中占据不同位置，大部分变异沿PC1方向，表明果实成熟与挥发性组成的重大协调变化相关。层次聚类热图进一步展示了成熟过程中挥发性谱的逐步重组，绿色（RS-1）和深红色（RS-4）阶段对多种化合物呈现明显对比的丰度模式，而淡橙色（RS-2）和浅红色（RS-3）阶段通常呈现中间谱型。反式石竹烯、2-乙基己醇、可巴烯、异贝壳杉烯和1-戊烯-3-酮是与成熟阶段分化显著相关的挥发性特征。
四、讨论与结论
成熟过程中山茱萸果实挥发性谱最显著的变化出现在酯类组。成熟与四种新酯类的检出相关：乙酸异戊酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯和乙酸己酯。成熟过程还引起醛类和醇类相对含量的大幅显著变化。醛类相对丰度的显著下降主要归因于己醛相对含量降低6倍，而醇类因乙醇和丁醇水平相对升高及己醇的出现而增加。
未熟绿色果实（RS-1）的特异性挥发性标志物包括相对高水平的己醛、2-己烯醛（E）、戊醇、1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、樟脑、贝壳杉烯、杜松烯、戊烷和二甲基硫醚，以及多种酯类和醇类（如己醇）的缺失。完全成熟果实（RS-4）则表现为相对高水平的乙醇、丁醇和己醇，以及多种酯类（以乙酸乙酯为主）和增加的乙酸。
本研究存在一定局限性：数据来自单一季节、单一地理位置的单一品种。未来需要涉及其他山茱萸品种、不同地理位置和多个生长季的研究，以更好地表征遗传和季节变异性对成熟过程中挥发性谱的影响。
研究结论表明，山茱萸果实的挥发性组成显著受成熟度影响，挥发性物质可作为识别成熟阶段的实时生物标志物。特别是乙醇、丁醇和己醇相对水平升高，伴随多种酯类（主要为乙酸乙酯）的出现和乙酸水平相对升高，表征了更高级的成熟阶段。SPME-GC/MS分析可为表征果实成熟度和识别与成熟相关的挥发性特征提供有用的分析方法，经进一步验证后，此类挥发性特征可支持成熟度评估和采收时间优化，以及用于加工的山茱萸果实的质量评价。
