REBOSEP：发育中小鼠脑组织边界空间转录组基因表达调控图谱与资源解析

《iScience》：Spatial transcriptomics profiling across tissue boundaries in the developing mouse brain

组织边界（tissue boundaries）在发育过程中维持结构完整性并引导细胞分化，尽管增殖、细胞死亡和组织变形持续施加压力。为研究这些区域中的基因调控，研究人员开发了REBOSEP，一种用于分析空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）数据以检测组织边界并测量基因表达相对于边界距离的工作流。REBOSEP使用层次聚类（hierarchical clustering）揭示基因间共享的调控模式，揭示可在仅几个细胞层内急剧变化的高度多样表达变化。利用该方法，该研究生成了首个跨组织边界的基因表达资源，涵盖发育中小鼠脑中的五个脑-脑膜边界。对背侧皮质-脑膜边界（dorsal pallium-meninges boundary）的分析显示，外脑层和脑膜层具有特异性调控模式，与发育过程以及主要通路中的距离依赖性调控密切相关，包括涉及神经发育疾病（neurodevelopmental disease）和癌症（cancer）的通路。总体而言，REBOSEP为研究组织边界处的基因表达调控提供了一个系统性框架。

研究背景与问题：组织边界（tissue boundaries）在发育中维持结构完整性并引导细胞分化，尽管增殖、细胞死亡和组织变形持续施加压力。未分化组织中存在区室边界（compartment boundaries）和非谱系边界（non-lineage boundaries）。区室边界中细胞身份可继承，选择基因维持均一性；非谱系边界中细胞命运由邻域连续信号决定。边界维持需要细胞信号，常见Notch信号和Wnt信号。癌症中肿瘤与健康组织边界破坏是恶性标志，边界粗糙度与侵袭性和不良预后相关。空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）发展促进局部转录活动和细胞互作研究。现有工具如BANKSY、BayesSpace、GraphST、Cell2location、Tangram用于组织域识别；Wu et al.于2023年分析人肝侵袭区，CellNeighborEX、Spateo、SPATA2、BELAYER、GASTON/GASTON-Mix等用于边界或层分析。但这些方法或计算重、侧重层或域分割、用分段结构表示边界相关表达，或未包含无监督模式识别。ST数据稀疏，binning未考虑细胞位置和身份，注释噪声大。因此需要高效、边界聚焦、无先验假设、能检测共享复杂表达模式的工作流，并构建发育中小鼠脑边界资源。研究人员开发REBOSEP，分析ST数据检测组织边界并测量基因表达相对边界距离，用层次聚类发现基因间共享调控模式；应用于E_16.5 C57BL/6小鼠胚胎Stereo-Seq数据，分析五个脑-脑膜边界，生成首个跨组织边界基因表达资源。分析背侧皮质-脑膜边界显示外脑层和脑膜层特异性调控模式，与发育过程和距离依赖性通路相关，包括神经发育疾病和癌症。REBOSEP提供系统框架，资源公开，具有重要意义。

技术方法概述：REBOSEP功能包括注释ST数据预处理、交互区域选择、边界识别、空间基因表达模式生成与绘图、模式聚类、数据导出和探索分析。输入注释ST数据如Stereo-Seq或Visium HD；过滤区域大小、手动选择感兴趣区（ROI）、检测相邻不同注释bin、连接连续边界、计算bin到边界最小距离、计算基因平均表达。使用动态时间规整（dynamic time warping, DTW）量化相似性，层次聚类分组。样本来源：CNGBdb项目CNP0001543的MOSTA Stereo-Seq E_16.5 C57BL/6小鼠胚胎矢状切片；10x Genomics的Visium HD E₁₅–E_15.5雌性小鼠胚胎数据集。

研究结果：A workflow to detect gene expression regulation across tissue boundaries：研究人员设计REBOSEP，包含预处理、交互区域选择、边界识别、模式生成和绘图、模式聚类、数据导出、探索分析。通过检测相邻不同注释bin并连接为连续边界，计算每个bin到边界距离，计算平均表达，然后用信号聚类识别共享模式。Reliable detection of tissue boundaries despite noisy tissue annotations：ST捕获率低导致需要binning，bin未考虑细胞位置和身份，Leiden聚类产生小、孤立错误注释。REBOSEP可过滤小随机簇、手动设置区域注释、手动选择特定边界区域、从小片段重建长边界并桥接短间隙，从而在噪声注释下可靠检测边界。Profiling boundary specific gene expression regulation in the brain during mouse embryogenesis：从公开MOSTA Stereo-Seq数据集选C57BL/6小鼠胚胎矢状切片，30×30 bins，分析背侧皮质-脑膜、中脑-脑膜、下后脑-脑膜、上后脑-脑膜、subpallium-脑膜五个边界。检测脑内深度达300 μm，脑膜距离限制150 μm。DTW可区分小至30 μm偏移。边界长度1,740–3,667 μm。层次聚类选6簇wb1–wb6，包括边界附近局部过表达、边界抑制和组织组成型表达。资源包含所有基因，含lncRNA和未知功能Riken基因。Associating gene expression profiles with biological processes in the dorsal pallium—Meninges boundary：对背侧皮质-脑膜边界层次聚类，检测到脑膜150 μm和脑内300 μm，选6个模式dp1–dp6做基因本体论（Gene Ontology, GO）富集。dp6全背侧皮质高表达与发育过程相关；dp1脑膜高表达富集细胞外基质（extracellular matrix, ECM）组织；dp2脑膜近边界过表达富集ECM组织和血管发育；dp3最强富集血管生成（angiogenesis）；dp4脑侧类似模式富集突触信号和传递；dp5脑边界强富集神经元投射和神经元发育。结论：不同细胞层富集ECM组织、血管生成和脑发育，峰表达局部化。Robustness and validation of boundary-associated expression patterns：重复Leiden聚类100次随机种子，簇内相似性高于簇间，簇内距离至少8倍小于簇间。Louvain与Leiden比较Spearman ρ = 0.939，p << 1e^?16。改变bin大小影响小，除100 bins损失空间细节。独立Visium HD E₁₅–E_15.5数据集验证，模式与Stereo-seq相似，峰位置、振幅和升降趋势保留。Regulation of pathways at the dorsal pallium—Meninges boundary：检查Wnt（mmu04310）、Notch（mmu04330）和细胞黏附（mmu04514）。Wnt：Fzd1和Fzd2在边界抑制，Rspo3约75 μm过表达，Apc峰在-50 μm，Ctnnd2和Tle4同层过表达，Ccnd2限制在-20–20 μm。Notch：脑侧约20–170 μm广泛抑制，Notch1–3脑膜高表达但边界和外脑层降低，Hes5脑膜和外脑层抑制，Hes1脑膜增加，Hdac1外脑层抑制，Atxn1和Tle4峰30–75 μm，Maml3外脑抑制。细胞黏附：神经元-神经元和生长锥-轴突相互作用基因表达限于边界约50–150 μm，脑膜低表达；Cntnap2、L1cam、Ncam1、Nrxn1、Nrxn2、Ptprd向深层脑区逐渐降低。结论：Notch外脑层广泛抑制，黏附分子约100 μm带，Wnt局部过表达和核心元素耗竭。

讨论部分总结：边界维持对健康组织发育关键， misregulation导致结构异常和成人恶性肿瘤。空间转录组学促进边界研究。REBOSEP优势包括检测连续表达信号、内置噪声组织处理、交互区域选择、无先验识别共享模式、直观距离度量；不将边界简化为大类，检测距边界达300 μm的连续变化；适用于噪声ST和复杂组织。资源公开。在背侧皮质，REBOSEP识别脑发育、血脑屏障和突触活动相关过程。通路可视化帮助理解调控。Wnt和黏附核心组件Apc、Ccnd2、Tle4、Ctnnd2，以及黏附分子L1cam、Nrcam、Cadm1、Cntn1在边界富集，许多与癌症和发育障碍相关；ASD相关Cadm1、Lrrc4、Nlgn1、Nrcam、Nrxn2；神经迁移和发育综合征Cdh2、Cntn1、L1cam、Lrrc4b、Ptprd。局限：基因水平解释为探索性和假设生成，需额外空间数据集和靶向实验；受ST数据质量和上游聚类影响；复杂组织可能需要多模态域调用；捕获率限制分辨率；binning降低精度；数据集来自雌鼠，性别特异性未评估。

研究结论翻译：总体而言，REBOSEP为研究组织边界处的基因表达调控提供了一个系统性框架。