单细胞图谱揭示 PTTG1 经 G2/M 检查点介导的细胞周期重编程驱动肠型胃癌进展并关联黏液相关上皮特征

《iScience》：PTTG1 drives intestinal-type gastric cancer progression via G2/M checkpoint-mediated cell-cycle reprogramming

肠型胃癌（intestinal-type gastric cancer, IGC）通过 Correa 级联进展，但这一转变的分子决定因素仍未得到充分界定。研究人员利用单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）对来自五例患者的匹配正常组织、肠上皮化生（intestinal metaplasia, IM）和肿瘤组织进行分析，鉴定出八种上皮亚型，包括一个沿疾病轨迹扩增的过渡性肠上皮细胞群体。拟时序和网络分析揭示 PTTG1（pituitary tumor-transforming gene 1）逐步上调，这一结果进一步得到公共队列、bulk 转录组学和组织微阵列（tissue microarray, TMA）的支持。功能实验表明，敲低 PTTG1 损害 G₂/M 检查点调控，并降低胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，而其过表达增强类器官生长并改变黏液相关特征。在异种移植模型（xenograft models）中，PTTG1 耗竭抑制肿瘤生长，并伴随分泌分化相关组织学变化。总之，这些发现提示 PTTG1 通过调控 G₂/M 检查点相关程序和调节黏液相关表型促进肠型胃癌进展，支持其作为 IGC 预防的风险生物标志物和候选治疗靶点的潜力。

肠型胃癌（intestinal-type gastric cancer, IGC）是胃癌的主要 Lauren 分型之一，通常被认为经 Correa 级联（Correa cascade）从非萎缩性胃炎（non-atrophic gastritis, NAG）、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生（intestinal metaplasia, IM）、异型增生进展为腺癌。尽管临床病理证据支持该模型，但驱动癌前病变向癌转变的分子机制仍不充分。单细胞 RNA 测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）已用于解析胃癌异质性，但沿 Correa 模型上皮细胞逐步恶性转化的机制仍不完全清楚。PTTG1（pituitary tumor-transforming gene 1）编码 securin 蛋白，参与染色体分离、细胞周期进程和有丝分裂保真，在多种恶性肿瘤中失调，在胃癌组织中较邻近正常黏膜升高，但其在胃致癌尤其上皮转化中的具体作用尚不明确。因此，研究人员开展本研究以解析 IGC 多阶段上皮状态转变并明确 PTTG1 的功能。

研究人员对五例未接受治疗的 IGC 患者手术标本进行 scRNA-seq，包括五份肿瘤组织、五份 IM 组织和三份 NAG 组织，并结合公共队列、bulk 转录组学和组织微阵列（tissue microarray, TMA）验证。功能上，研究人员在胃癌细胞系和胃类器官中进行 PTTG1 缺失和获得功能实验，并通过异种移植（xenograft）小鼠模型进行体内验证。研究得出结论：PTTG1 与 Enterocytes-S3 过渡状态相关，并通过调控 G₂/M 检查点相关程序和调节黏液相关表型促进 IGC 进展，支持其作为 IGC 预防的风险生物标志物和候选治疗靶点。该研究提供了胃癌发生过程中上皮状态转变的单细胞分辨视图，强调 PTTG1 是值得进一步研究的候选分子特征。

技术方法概括：研究人员对五例 IGC 患者的 13 份样本进行 scRNA-seq（5 肿瘤、5 IM、3 NAG），并利用拟时序分析和加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）解析上皮状态与模块；采用 CellPhoneDB 分析细胞互作；公共队列包括 TCGA-STAD、ACRG（GSE66229）和 HRA008551，TMA 来自苏州大学第二附属医院 99 对胃腺癌样本（最终 88 对，64 例 IGC 和 24 例弥漫型胃癌（diffuse-type gastric cancer, DGC））；在 MKN1、MKN7 细胞和胃类器官中进行 siRNA/慢病毒敲低或过表达，在 BALB/c 裸鼠中进行异种移植，并结合 RNA-seq、RT-qPCR、western blotting、流式细胞术、CUT&RUN-qPCR、免疫组化（immunohistochemistry, IHC）、免疫荧光（immunofluorescence, IF）和 AB-PAS 染色。

单细胞转录组图谱揭示多阶段 IGC 的细胞异质性。研究人员对 13 份标本的 55,785 个细胞进行 scRNA-seq，鉴定出 B 细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、恶性细胞、肥大细胞、髓系细胞、浆细胞和 T 细胞九种主要细胞类型；随病变阶段进展，髓系细胞、内皮细胞和成纤维细胞比例逐渐增加，恶性上皮细胞比例在 IGC 中升高。

上皮谱系映射识别与恶性进展相关的过渡亚型。研究人员再聚类上皮细胞获得八种亚型，包括主细胞、内分泌细胞、肠上皮细胞、杯状细胞、颈细胞、壁细胞、小凹细胞和肿瘤细胞；拟时序轨迹从颈细胞指向肠上皮细胞，并定义 Enterocytes-S3 为介于非恶性与恶性状态之间的过渡性肠上皮细胞群体。基于既往报道的不完全肠上皮化生（incomplete intestinal metaplasia, IIM）特征基因计算评分，该评分从颈细胞到 Enterocytes-S2 和 Enterocytes-S3 逐渐升高，随后在 IGC 细胞中下降。WGCNA 显示 Module 4 在 Enterocytes-S3 中显著上调，富集有丝分裂核分裂和细胞周期相变；Enterocytes-S3 的 Hallmark_G₂M_Checkpoint 和 Hallmark_E2F_Targets 特征评分升高，并与多种细胞类型增强配体-受体互作。

PTTG1 与 Enterocytes-S3 状态和 IGC 恶性进展相关。研究人员将 Enterocytes-S3 特征应用于 TCGA-STAD 转录组，发现 PTTG1 是高评分样本中最显著上调基因；拟时序分析显示 PTTG1 从肠上皮细胞向 IGC 逐步上调，在 IGC-S3 簇最高。TCGA-STAD、ACRG 和 HRA008551 数据中，Enterocytes-S3 评分和 PTTG1 表达在胃癌中较正常组织升高；配对分析显示 IGC 中 PTTG1 较匹配正常黏膜升高。TMA 的 IHC 显示 IGC 样本 PTTG1 强核染色，而邻近正常组织弱或无染色，且 IGC 中 PTTG1 表达高于 DGC。

PTTG1 通过调控 G₂/M 检查点促进胃癌细胞恶性表型。研究人员用 siRNA 在 MKN1 和 MKN7 中敲低 PTTG1，CCK-8 和 EdU 实验显示细胞增殖受抑，Transwell 实验显示迁移和侵袭降低。RNA-seq 的 GO 富集分析显示差异表达基因富集于有丝分裂核分裂和姐妹染色单体分离等细胞周期过程，GSEA 提示 G₂/M 检查点通路改变。流式细胞术显示 PTTG1 敲低后 G₂ 期细胞减少、G₁ 期细胞积累；western blotting 显示 Cyclin B1 和 p-CDK1 下调、γH2AX 升高；IF 显示 γH2AX 焦点增加。进一步分析显示 PTTG1 敲低降低 E2F1 mRNA 和蛋白水平以及 CCNB1 mRNA 表达；CUT&RUN-qPCR 显示 E2F1 在 CCNB1 启动子富集，PTTG1 敲低后该富集显著减少，提示 PTTG1 至少部分通过调节 E2F1 依赖性转录活性调控 Cyclin B1 表达。

PTTG1 过表达增强胃类器官增殖和黏液相关肠化生特征。研究人员在 IGC 患者癌旁胃类器官中过表达 PTTG1，发现类器官第 6、10、12 天直径显著增大，Ki67 表达增加，Cyclin B1 表达升高且部分上皮细胞核定位更常见；Alcian blue 染色增强，MUC2 免疫荧光和 western blotting 显示 MUC2 表达增加。结论提示 PTTG1 过表达促进类器官生长，并与 MUC2 表达增加及黏液相关肠化生样特征相关。

PTTG1 沉默抑制异种移植瘤生长并与分化相关黏液变化相关。研究人员用 shPTTG1#1 和 shPTTG1#2 建立稳定敲低 MKN1 细胞，皮下注射 BALB/c 裸鼠；PTTG1 敲低显著抑制肿瘤进展，肿瘤体积和重量降低，IHC 显示 Ki67 和 Cyclin B1 表达减少及 H-Score 降低；AB-PAS 染色显示 shPTTG1 肿瘤黏液相关染色增加，但 MUC2 IHC 无显著差异，cleaved caspase-3 染色无显著变化。结论表明 PTTG1 在体内通过调节 G₂/M 检查点相关蛋白表达促进胃癌进展，其耗竭损害肿瘤生长并诱导分化相关黏液变化。生存分析显示 PTTG1 表达与总生存无显著关联（TCGA-STAD p=0.76，ACRG p=0.23），提示其可能主要反映肿瘤内在调控程序而非独立预后因素。

讨论部分总结：研究人员将本研究置于 scRNA-seq 解析胃癌异质性和 Correa 级联的背景下，并提及 Zhang et al. 和 Su et al. 的既往工作。本研究的 NAG、IM 和 IGC 单细胞图谱揭示髓系、内皮和成纤维细胞扩增以及恶性上皮细胞增加；Enterocytes-S3 具有非恶性与恶性之间的转录特征，IIM 评分变化支持其中间状态，但其直接致瘤潜力尚待确定。WGCNA 发现细胞周期相关模块，PTTG1 为关键 hub 候选，沿拟时序持续升高。PTTG1 最初在大鼠垂体肿瘤细胞中鉴定，在多数正常组织低表达（除外睾丸），在多种癌症中高表达。公共数据和 IHC 验证 PTTG1 在 IGC 中高于正常或化生组织，且 IGC 高于 DGC。功能实验显示 PTTG1 促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，敲低在体内外抑制肿瘤生长。机制上，转录组提示 G₂/M 检查点下调，PTTG1 耗竭减少 G₂ 期细胞，符合 G₂/M 进展受损而非经典 G₂/M 阻滞。研究人员提出 PTTG1 可能通过 E2F1 调节 CCNB1，CUT&RUN-qPCR 支持该轴，但 PTTG1 调控 E2F1 的上游机制尚不清楚。γH2AX 增加提示 DNA 损伤相关信号积累，PTTG1 可能协调细胞周期进程与基因组稳定性。PTTG1 表达与生存或临床病理参数无显著关联，提示其参与肿瘤内在生物学过程。类器官和异种移植模型提示 PTTG1 与黏液相关上皮特征的关系具有情境依赖性：类器官过表达增加 Alcian blue 和 MUC2，而异种移植敲低增加 AB-PAS 染色但 MUC2 不变；AB-PAS 检测酸性和中性黏蛋白且不区分亚型，因此该变化可能反映更广泛的黏液相关组织学改变。研究局限包括 scRNA-seq 组织解离丢失胃腺轴空间信息、横断面设计无法完全捕捉时间动态、样本量有限且性别分析不足、Enterocytes-S3 功能尚待建立、需要更生理相关系统如气液界面类器官评估成熟黏蛋白产生和上皮分化，以及 PTTG1 调控 E2F1 的上游机制需进一步研究。

结论翻译：总之，研究人员的研究提供了胃癌发生过程中上皮状态转变的单细胞分辨视图，并鉴定 PTTG1 为与上皮状态转变和 IGC 进展相关的调控因子。这些发现为 Correa 级联的细胞动力学提供了见解，并强调 PTTG1 是值得进一步研究的候选分子特征。