《Microorganisms》：Virulence Signatures and Biofilm-Forming Capacity of ESBL-Producing Escherichia coli in Wastewater and Agricultural Environments
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摘要：产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）大肠杆菌（E. coli）在家畜和市政废水系统中的持续存在，代表了抗菌药物耐药性（AMR）和毒力决定因素的关键环境传播途径，对公共健康具有直接影响。本研究调查了来自两座市政污水处理厂（WWTP）、一家家禽养殖场和一家牛养殖
摘要：产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）大肠杆菌（E. coli）在家畜和市政废水系统中的持续存在，代表了抗菌药物耐药性（AMR）和毒力决定因素的关键环境传播途径，对公共健康具有直接影响。本研究调查了来自两座市政污水处理厂（WWTP）、一家家禽养殖场和一家牛养殖场的产ESBL大肠杆菌中毒力基因的分布及生物膜形成能力。研究人员于2025年5月至2026年5月期间共收集了452份环境样本。通过基于培养和生化方法鉴定产ESBL大肠杆菌。采用聚合酶链式反应（PCR）和全基因组测序（WGS）对毒力基因进行表征。利用结晶紫微量滴定板法评估生物膜形成。在452份样本中，120份（26.5%）检出产ESBL大肠杆菌。PCR分析显示，家禽养殖场分离株中毒力基因的流行率最高，主要为traT（64/66）、ompA（61/66）、fimH（54/66）和chuA（39/66），其次是来自WWTP-A、牛养殖场和WWTP-B的分离株。不同采样来源间traT（p = 0.0398）和stx1（p = 0.0224）的差异显著。WGS分析发现多个毒力基因与来源存在显著关联，其中esp（FDR = 3.47 × 10?6）和fimH（FDR = 2.36 × 10?5）的关联性最强。大多数分离株为非生物膜产生菌（52/120，43.3%）。在生物膜形成分离株中，弱生物膜产生在所有采样地点均占主导地位，家禽养殖场分离株的流行率最高（21/120，17.5%），其次是牛养殖场和WWTP-A（各10/120，8.3%）以及WWTP-B（7/120，5.8%）。这些发现确定了家禽养殖场和废水环境是携带毒力因子的产ESBL大肠杆菌的重要储库，并支持采取整合的One Health监测策略以限制AMR的环境传播。
研究背景、存在问题与研究意义
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种革兰阴性杆菌，常见于温血动物下消化道，并通过粪便和废水排放进入环境。虽然多数菌株为无害共生菌，但某些致病菌株可引发严重食源性疾病。废水处理厂（wastewater treatment plants, WWTPs）在减少病原体环境传播方面发挥关键作用，但常规处理工艺可能无法完全消除致病性或抗菌药物耐药性细菌。产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase, ESBL）大肠杆菌因其能够水解包括第三代头孢菌素在内的多种β-内酰胺类抗生素而成为临床最显著的耐药病原体之一。全球范围内产ESBL大肠杆菌的增加与治疗失败、住院时间延长、医疗成本上升及死亡率升高相关。这些耐药菌株在废水和农业环境中的持续存在进一步凸显了其作为抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）和毒力决定因素环境储库的重要性。然而，关于毒力基因谱和生物膜形成能力在产ESBL大肠杆菌环境持久性与传播中的综合作用的信息仍然有限。因此，本研究旨在表征从北卡罗来纳州费耶特维尔废水与农业环境中分离的产ESBL大肠杆菌的毒力特征和生物膜形成能力，并在One Health框架下评估这些因素如何促进AMR大肠杆菌在人、动物与环境界面的持久性和传播。
研究方法概述
研究人员在2025年5月至2026年5月的12个月采样期内，从美国北卡罗来纳州费耶特维尔的两座市政废水处理厂（WWTP-A和WWTP-B）、一家肉牛养殖场和一家混合物种后院家禽养殖场共采集452份环境样本，涵盖废水、动物粪便、农场用水和土壤四类基质。采用MacConkey琼脂和含头孢噻肟的MacConkey琼脂进行培养筛选，通过生化试验确认大肠杆菌，并使用CLSI联合纸片扩散法表型确证ESBL产生。毒力基因检测采用多重聚合酶链式反应（multiplex PCR）和全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），后者对53株分离株进行了测序分析。生物膜形成能力采用结晶紫微量滴定板法测定。数据分析采用Fisher精确检验、卡方检验、Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate, FDR）校正及主成分分析（principal component analysis, PCA）。
研究结果
3.1 产ESBL大肠杆菌中毒力基因的分布
在452份样本中，120份（26.5%）检出产ESBL大肠杆菌。总体而言，ompA（114/120，95%）和traT（113/120，94.2%）是最常检出的基因，其次为fimH（104/120，86.7%）和chuA（82/120，68.3%）。家禽养殖场分离株携带的毒力基因流行率最高。
3.2 毒力基因在不同采样地点的分布
毒力基因分布因采样地点而异。家禽养殖场分离株（n=66）中毒力基因频率最高，其次为WWTP-A（n=22）、牛养殖场和WWTP-B。WGS分析经FDR校正后显示，esp（FDR=3.47×10-6）和fimH（FDR=2.36×10-5）与分离株来源的关联性最强，此外yagV/ecpE、iroB、fes、ykgK/ecpR、gspC、fepA、ent和fdeC也表现出显著差异。而hlyA、csgB、gtrA、stx2A/B、ompA、aslA、chuA、eae和shuA未呈现显著来源差异。
3.3 毒力基因在不同环境样本来源中的分布
粪便分离株中毒力决定因素的流行率最高，进水废水分离株次之，而出水、土壤和水样分离株携带的毒力基因相对较少。traT（原始p=0.0398）和stx1（原始p=0.0224）在不同来源间的流行率差异显著。
3.4 毒力基因丰富度的来源依赖性差异
WGS亚组分析显示，牛养殖场分离株毒力基因丰富度中位数约为11~12个基因，家禽养殖场分离株变异较大（约5~15个基因），WWTP-A分离株异质性高（范围0~约12个基因），WWTP-B分离株丰富度最低（主要集中在2~3个基因）。农业来源分离株的毒力基因丰富度整体高于废水处理厂来源分离株。
3.5 毒力基因谱的主成分分析
PCA显示不同来源分离株之间存在较大重叠，表明毒力基因组成并非完全来源特异性。牛养殖场和家禽养殖场分离株多聚集于PC1正值区域，而部分WWTP-A和WWTP-B分离株分布于PC1负值区域。WWTP-A分离株在PCA空间中分散程度最大，牛养殖场分离株则形成较紧密的聚类。
3.6 不同生物膜类别中产ESBL大肠杆菌毒力基因的分布
非生物膜形成分离株是最大的群体，其大多数毒力基因的计数最高。弱生物膜产生菌也显示出显著的基因存在，特别是ompA、traT和fimH。强生物膜产生菌数量极少且携带的毒力基因计数较低。
3.7 不同采样地点生物膜形成能力的分布
弱生物膜形成是所有地点生物膜产生菌中的主要表型，家禽养殖场最为常见（n=21），其次为牛养殖场和WWTP-A（各n=10）以及WWTP-B（n=7）。强生物膜形成罕见，仅在家禽养殖场（n=1）和WWTP-B（n=1）中检出。Bfp、eaeA、stx1、iucD和traT均与生物膜类别存在统计学显著关联（p<0.01），而chuA、fimH和ompA无显著关联。
3.8 多位点序列分型（MLST）
MLST分析揭示了测序分离株中存在显著的遗传异质性。ST602是主要序列型，仅在家禽分离株中检出（n=6），其次为ST2063（n=3）。牛分离株中多个序列型各有2株代表。废水来源分离株遗传多样性高，仅ST636出现两次（n=2）。
讨论总结与结论翻译
讨论指出，产ESBL大肠杆菌中广泛检出毒力相关基因，尤其是粘附、定植、血清抵抗和持久性相关基因（如ompA、traT、fimH、chuA），表明环境储库有能力携带具有增强致病潜力的菌株。低流行率的eaeA和stx1提示经典腹泻原性毒力决定因素在这些环境分离株中不常见，肠外毒力机制可能在废水和农业环境中循环的产ESBL大肠杆菌中占主导地位。地点特异性差异反映了环境条件和选择压力对毒力基因谱的塑造作用，家禽养殖场分离株毒力基因频率最高，WWTP-A次之。粪便和进水废水分离株携带最丰富的毒力决定因素，而出水、土壤和地表水分离株较少，但出水中的持续检出提示潜在致病菌可能存活于处理后进入受纳水体。粘附相关基因（如esp、fimH、fdeC等）和铁获取基因（如iroB、fepA、fes、ent）的来源依赖性分布暗示生态起源影响细菌附着、定植和竞争适应性状。主要毒力基因（eae、stx2A/B、hlyA）无显著来源差异，提示致病潜力并不局限于特定环境或农业储库。PCA的重叠模式支持农业和废水储库之间的相互连通性。弱生物膜产生菌的主导地位表明多数分离株具备足以在废水系统和农业环境中存活的生物膜形成能力，但毒力基因携带本身不一定预测生物膜表型。
研究结论：本研究表明，废水处理厂和畜牧生产环境是携带多种AMR决定因素、毒力相关基因和生物膜形成能力的产ESBL大肠杆菌的重要储库。粘附和持久性相关毒力基因的优势地位以及广泛的生物膜形成能力，突显了这些环境分离株生存、持续存在并可能促进AMR传播的能力。家禽养殖场和废水分离株中毒力基因的较高频率进一步强调了环境和农业环境对维持潜在致病大肠杆菌的影响。这些发现共同强化了在人-动物-环境界面采用One Health方法监测AMR细菌的重要性。
