《Microorganisms》：Complementary Use of Shotgun Metagenomics and Multiplex PCR for Pathogen Detection on High-Touch Surfaces
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鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomics）正日益被推广为针对靶向PCR（targeted PCR）的病原体非预知性替代方案，用于环境监测，但其在干燥、低生物量（low-biomass）、宿主主导型表面上的实际应用价值仍不确定。在一项配套研究
鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomics）正日益被推广为针对靶向PCR（targeted PCR）的病原体非预知性替代方案，用于环境监测，但其在干燥、低生物量（low-biomass）、宿主主导型表面上的实际应用价值仍不确定。在一项配套研究中，研究人员曾报道使用QIAstat-Dx多重PCR（multiplex PCR）对来自利雅得的55份混合高接触表面样本进行筛查，鉴定出19份阳性混合样本（34.5%）。在此，在一项回顾性探索性比较中，研究人员将先前报道的PCR检测结果作为靶向对照，探讨未经富集的鸟枪法宏基因组测序能提供何种额外信息。研究人员对10份存档混合样本（每份至少含有一个PCR检出的病毒靶标）进行了测序（Illumina NovaSeq X Plus，2 × 150 bp）。人源比对读段（human-mapped reads）在每份文库中均占相当大比例（平均值59.1%；范围42.1–80.2%）。在14个可评估的PCR阳性靶标事件中，宏基因组测序在10个事件中（71.4%；精确95% CI，41.9–91.6%）将至少一个读段对（read pair）分配给相应靶标分类单元。由于该队列因病毒PCR阳性而被预先选择，该值代表所选队列内的阳性一致性/分类学一致性，而非诊断灵敏度。在同一≥1读段对阈值下，靶标分类单元也被分配给246个可评估的混合样本-靶标单元（pool-by-target cells）中PCR阴性的91个（37.0%）；将阈值提高至≥10读段对可将阳性一致性降至35.7%，而背景分配仍为24.8%。在具有PCR阳性事件的六个靶标类别中，仅冠状病毒229E（coronavirus 229E）在其PCR阳性混合样本中分配的读段对多于任何PCR阴性混合样本。在所有十个混合样本中，PCR阳性检出所代表的三种呼吸道RNA病毒分类单元合计仅占105个已分类读段对——包括在PCR阳性和PCR阴性混合样本-靶标单元中的分配——相当于病毒组分的0.12%。即使是最广泛的病毒参考覆盖也有限，HP10中的腺病毒（adenovirus）达到16.39%（23个不同比对跨度），而CP17中的SARS-CoV-2达到8.83%（12个跨度）；这些部分性、不连续的比对不足以支持稳健的全基因组共有序列重建或全基因组变异及系统发育分析。尽管如此，宏基因组测序提供了超越靶向panel的更广泛分类学背景。在这种回顾性未富集工作流程下，靶标回收率可变，所测试的分配阈值均无法将PCR阳性靶标信号与背景分配区分开来，且鸟枪法宏基因组测序在该数据集中提供的是生态学背景，而非作为靶向多重PCR的可靠替代方案。
高接触表面病原体监测：鸟枪法宏基因组测序与多重PCR的互补性评估
一、研究背景与问题提出
20世纪大部分时间里，环境与临床传染病监测依赖基于培养的方法，该方法虽具有特异性强、可支持下游表型分析等优势，但操作缓慢、劳动密集，且偏向于在标准条件下易于培养的微生物。这些局限性推动了公共卫生和临床微生物学向分子及测序方法的广泛转变。靶向核酸检测（如PCR和多重panel）大幅提高了速度和分析灵敏度，但仍依赖于对检测病原体的先验知识。在此背景下，宏基因组下一代测序（mNGS）作为无需预设引物集即可调查病毒、细菌、真菌和寄生虫核酸的非靶向方法应运而生。
环境宏基因组学在高生物量基质（如废水）中取得了突出成果，密集的病毒和细菌载量可产生丰富的微生物读段和稳健的组装结果。然而，干燥的污染物和高接触表面代表了几乎相反的场景：这类表面通常微生物生物量低，且以外源DNA（来自人类、灰尘和建筑环境）为主导，将测序推向检测极限。低生物量样本特别容易受到环境和试剂污染的影响，因为背景DNA极易淹没真实的微生物信号。同时，高接触表面积累大量宿主物质（皮肤细胞、汗液、黏膜飞沫），即使少量人类细胞也可能完全淹没微生物DNA。共识指南因此将低生物量环境列为需要特殊方案、密集阴性对照和谨慎解读的特殊场景。
本研究旨在对高接触表面上的呼吸道和肠道病原体靶标，开展靶向分子综合征panel与非靶向宏基因组测序之间的回顾性探索性比较。QIAstat-Dx呼吸道SARS-CoV-2 panel和QIAstat-Dx胃肠道panel 2提供了靶向对照，Illumina鸟枪法宏基因组测序则提供非靶向分类学调查。与前瞻性诊断准确性研究不同，本研究使用PCR筛查后选择的存档混合样本，因此并非为估计诊断灵敏度或特异性而设计，而是聚焦于靶标水平阳性一致性、PCR阴性单元中的背景分类学分配、阈值依赖性、基因组水平支持以及测序所回收的更广泛分类学背景。
二、主要技术方法
研究人员对来自利雅得2023年2月至2024年5月期间采集的55份混合环境样本中，经QIAstat-Dx筛查后选取的10份含至少一个病毒PCR阳性事件的存档混合样本进行了Illumina NovaSeq X Plus平台双端2 × 150 bp鸟枪法宏基因组测序。生物信息学分析采用fastp进行接头和低质量碱基去除，使用bwa-mem2比对至人类参考基因组（GRCh38）进行宿主消耗，随后使用Kraken2（v2.17.1）基于Standard Plus Protozoa and Fungi数据库（k2_pluspf_20250714）进行分类学分类。研究人员通过自定义Python脚本将Kraken2分类标识符映射至QIAstat-Dx panel靶标，在≥1、≥5和≥10读段对三个探索性阈值下评估一致性，并对所有PCR+/mNGS+组合进行参考比对和重复感知的二次分析。
三、研究结果
3.1 高接触表面样本中的人源比对读段负担
人源比对读段占全部10份测序表面混合样本的相当大比例，平均59.1%（范围42.1–80.2%）。HP6显示80.2%的人源读段，CP20显示42.1%。测序后每份混合样本中位数约1780万读段对，人源读段去除后中位数约680万非人源读段对。高宿主背景显著减少了可用于病原体检测的有效微生物文库规模。
3.2 PCR与鸟枪法宏基因组测序的一致性
在≥1读段对阈值下，14个可评估PCR阳性事件中有10个（71.4%；精确95% CI，41.9–91.6%）获得相应靶标分类单元的分配，包括7个病毒事件（CP17中的SARS-CoV-2、HP10/HP2/CP18中的腺病毒、AP7中的冠状病毒229E、AP5和HP6中的鼻病毒/肠道病毒）和3个非病毒事件（CP17中的霍乱弧菌、AP7和CP20中的隐孢子虫）。在≥5读段对时阳性一致性降至42.9%，≥10读段对时进一步降至35.7%。
3.3 PCR阴性单元中的背景分类学分配
在246个可评估的PCR阴性混合样本-靶标单元中，91个（37.0%）被分配至少一个读段对至靶标分类单元。霍乱弧菌在所有十个混合样本中均有分配（156–1393读段对），其中HP10的计数（1393）超过了PCR阳性CP17的计数（1251）。在具有至少一个PCR阳性事件的六个靶标类别中，仅冠状病毒229E在其PCR阳性混合样本中的读段对分配多于任何PCR阴性混合样本。提高阈值并未消除背景：≥5读段对时背景分配为28.5%，≥10读段对时仍为24.8%。所测试的阈值均无法将PCR阳性靶标信号与背景分类学分配区分开来。
3.4 一致性分配的参考比对与重复感知检验
CP17的SARS-CoV-2事件中，初始Kraken2分类分配了212个读段对，但比对过滤显示其中173个（81.6%）为人源序列被错误分类，仅剩39个高置信读段对。参考比对至NC_045512.2后，这些读段分布在8个不连续簇中，覆盖8.83%的基因组，折叠为12个不同的配对比对跨度。对全部10个PCR+/mNGS+组合的扩展检查显示异质性支持：4个具有主要全长比对支持，2个仅有短片段部分支持，4个稀疏属水平分配未比对至所选代表参考序列。重复感知的跨度计数显著低于原始配对计数，表明相同比对位置的重复覆盖。
3.5 鸟枪法宏基因组更广泛的分类学组成
分类学分类显示细菌占绝对优势（50,426,022个已分类读段对；97.6%），真核生物（2.1%）、古菌（0.09%）和病毒（0.16%）比例较小。最丰富的分类单元包括痤疮皮肤杆菌、环境双歧杆菌、鞘氨醇单胞菌和限制马拉色菌等，与反复触摸表面的特征一致。病毒组分中噬菌体占主导（64.8%），RNA病毒（23.0%）以植物病毒为主。PCR阳性检出所代表的三种呼吸道RNA病毒分类单元合计仅105个已分类读段对，占病毒组分的0.12%。
四、讨论与结论
4.1 未富集宏基因组中靶标回收率降低与背景分配
在≥1读段对阈值下，宏基因组测序对7/11个病毒和全部3个可评估非病毒PCR阳性事件产生了相应分类学分配（10/14；71.4%），但同一阈值将靶标分类单元分配给37.0%的PCR阴性单元，因此这些匹配不能被视为PCR检出的独立确认。病毒支持普遍稀疏，且低计数k-mer分配无法在测试阈值下可靠区分PCR阳性和PCR阴性单元。事后比对分析进一步表明，10个PCR+/mNGS+单元中仅4个具有主要全长支持，2个仅有短片段部分支持，4个稀疏属水平分配未比对至所选代表参考序列。
4.2 “室内城市”因素：利雅得作为代表性挑战环境
利雅得的建筑环境如同“室内城市”，人们大部分时间在空调室内度过，反复接触相同表面，同时密集清洁制度用于维持卫生。高接触表面积累大量人源相关物质，频繁清洁消毒降低整体微生物生物量，形成低病毒、高背景的挑战性基质，这与未靶向宏基因组回收的已知困难相符。
4.3 建议：靶标富集作为未来策略
鸟枪法宏基因组测序提供了超越靶向panel的更广泛分类学背景，包括共生菌、环境菌和panel外病毒分类单元的分配。但病毒分配仅占已分类读段对的0.16%，三种呼吸道RNA病毒分类单元合计仅105个读段对。靶标回收率可变且无法仅以Ct值或宿主比例解释。靶向PCR和非靶向测序在本数据集中是互补而非可互换的：前者提供定义panel靶标的靶向扩增，后者提供更广泛的分类学和发现背景。未来研究应考虑优化预处理/宿主减少、病毒富集、测序提取空白和文库空白对照、定义阳性加标对照，以及从相同提取物进行PCR和测序的前瞻性平行处理。
4.4 研究局限性
本研究存在多项重要局限：十份测序混合样本为PCR筛查后回顾性选择，无法估计诊断灵敏度或特异性；未包含测序提取空白、文库/无模板对照或定义阳性加标对照；≥1读段对阈值有意宽松；未进行实验性宿主基因组DNA消耗；两种方法应用于存档材料的不同存储时间点，存在额外的冻融循环和国际运输；研究仅代表特定干旱城市表面监测队列的十份存档混合样本。
4.5 研究结论
这项回顾性探索性比较发现，未富集鸟枪法宏基因组测序仅对预先选择的PCR阳性靶标集的一部分产生了相应分类学分配，同时在PCR阴性混合样本-靶标单元中产生了大量靶标分配。在≥1读段对阈值下，阳性一致性为71.4%（10/14；精确95% CI，41.9–91.6%），背景分配为37.0%；在≥10读段对时，一致性降至35.7%，背景仍为24.8%。这些结果不应被解读为诊断灵敏度/特异性估计或某一平台普遍优越的证据，而是表明在此低生物量、宿主主导的回顾性数据集中，使用低计数、未富集k-mer分类学分配作为独立病原体检出的局限性。事后参考比对进一步显示，表面一致的分配具有异质性：4个具有主要全长支持，2个仅有短片段部分支持，4个稀疏属水平分配无支持。宏基因组测序仍提供了靶向panel无法提供的更广泛分类学背景，但对于回收先前报道的低模板panel靶标这一特定任务，多重PCR产生的靶向阳性检出多于未富集鸟枪法工作流程。未来前瞻性比较应从相同提取物平行处理两种方法，并纳入测序阴性对照、阳性加标对照、正交参考比对以及富集臂，以更严格地评估靶向PCR和宏基因组测序在高接触表面监测中的相对作用。
